CXCL12/CXCR4生物学轴及AMD3100对舌鳞癌Tca8113细胞侵袭行为的影响

王钢 董国伟

舌癌是我国最常见的口腔颌面部恶性肿瘤之一，恶性程度高，浸润性强［1］。本实验旨在通过应用CXCL12及其抑制剂 AMD300，作用于体外培养的Tca8113细胞，应用PCR检测Tca8113细胞表面CXCR4受体mRNA表达量;通过Transwell小室侵袭实验研究该学轴对Tca8113细胞侵袭转移过程中所发挥的作用及AMD3100对此过程的干预。

1 材料与方法

1.1 细胞株

舌鳞癌细胞Tca8113购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 主要材料

培养基 RPMI 1640、胎牛血清(杭州四季青公司);CCK-8试剂(Sigma，美国);DMSO(二甲亚砜)、CXCL12因子、AMD3100、CXCR4抗体(北京博奥森生物技术有限公司);Taq DNA聚合酶(Transgene)、Matrigel(BD公司，美国);Transwell小室及配套孔板(Costar公司，美国)等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 Tca8113细胞于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养液(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)，37℃、5%CO2的饱和湿度孵箱中培养，每2～3 d换液1次，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3.2 逆转录PCR 检测一定浓度的CXCL12及其特异性抑制剂AMD3100对Tca8113细胞CXCR4受体mRNA表达量的影响，分4组:对照组;CXCL12因子刺激组(CX组)，调整CXCL12因子的终浓度为100 ng/ml;单独 AMD3100组(AMD组)(终浓度为 1 μg/ml);AMD3100干预组(1μg/ml)，AMD3100预先孵育细胞1 h后加入终浓度为100 ng/ml CXCL12因子(AM+CX组)，干预后培养48 h，提取细胞的总RNA;按照逆转录试剂盒说明书扩增目的基因。

1.3.3 侵袭转移 采用铺有Matrigel的 Transwell小室研究Tca8113细胞的侵袭转移力。实验细胞分组同上，用含0.1%BSA的无血清RPMI 1640稀释重悬，计数，调整细胞浓度;抽取200μl细胞悬液接种于transwell上室内，transwell下室加入含有20%FBS的RPMI 1640培养液600μl;孵育24 h，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞及膜面的Matrigel，PBS漂洗，多聚甲醛固定，苏木精染色15 min，流水冲洗10 min，盐酸酒精分化2 s，自来水冲洗10 min，然后置于空气中风干。用手术刀将膜切下后，盖上盖玻片，中性树胶封片，待过夜后干燥即可长期保存。倒置显微镜下，随机选取膜上5个不同视野计数穿过膜的细胞数，重复3次，求平均值。

1.4 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，实验数据均以珋x±s表示。计量资料进行单因素方差分析，两两分析比较结果。

2 结果

2.1 逆转录PCR

CXCR4受体 mRNA的表达量以 CXCR4受体DNA条带灰度值和内参照基因GAPDH的DNA条带灰度值的比值表示(表1，图1)。CXCR4受体基因的灰度值与内参的灰度值的比值代表CXCR4 mRNA的表达量。

图1 CXCR4 mRNA的表达Fig 1 CXCR4 mRNA expression of the 4 groups

表1 各组细胞CXCR4 mRNA的表达Tab 1 CXCR4 mRNA expression of the cells of the 4 groups

2.2 侵袭实验

体外侵袭实验表明:CXCL12因子刺激组穿膜细胞数目最多，AMD3100预先孵育组穿膜细胞数目最少，对照组和单独AMD3100的穿膜细胞数目差别不明显。预先孵育CXCR4受体的拮抗剂AMD3100可以对抗CXCL12因子对肿瘤细胞的趋化作用，使穿膜细胞数低于CXCL12刺激组。计算趋化指数(CI)，CI=趋化因子CXCL12组平均穿膜的细胞总数/对照组平均穿膜的细胞总数，侵袭抑制率(IR)，IR=(趋化因子CXCL12组平均穿膜的细胞总数－抑制剂预先孵育组平均穿膜的细胞总数)/趋化因子CXCL12组平均穿膜细胞总数×100%。

CXCL12因子刺激组穿膜细胞数目为平均(75.1±2.9)个，而AMD3100预先孵育组穿膜细胞平均数目减少为32.2 ±1.9，经 SPSS统计分析，CXCL12 因子刺激组与AMD3100预先孵育组的穿膜细胞数目差异有统计学意义(P＜0.05)，单独AMD3100组和对照组之间穿膜细胞数目差异无统计学意义(P＞0.05)(表2，图2)。

表2 各组穿膜细胞数(珋x±s)Tab 2 The invaded cells throught the transwell membrane of the 4 groups(珋x±s)

3 讨论

CXCL12/CXCR4生物学轴是指由趋化因子CXCL12，与CXCR4互相连接而形成的一个偶联分子对［2］，此生物学轴与多种恶性肿瘤细胞的侵袭、器官特异性转移等密切相关［3－4］。

A:对照组;B:CX组;C:AMD组;D:AM+CX组图2 4组穿膜细胞 (苏木精染色，×100)A:Control group;B:CX group;C:AMD group;D:AM+CX groupFig 2 The invaded cells throught the transwell membrane of the 4 groups (×100)

肿瘤细胞高表达特异的趋化因子受体，而特异性的器官高表达其相应的配体，趋化因子与其受体相互结合，导致出现癌细胞器官特异性的转移。Muller等［5］研究显示:涎腺腺样囊性癌细胞可检测到，CXCR4 受体的高表达，AlmoftiA 等［6］和李五一等［7］研究结果显示口腔鳞癌细胞表达CXCR4受体。越来越多的研究证实:CXCR4受体可以在多种肿瘤细胞表面表达，与相应的趋化因子相互作用，相互结合，影响肿瘤细胞的相关生物学行为。

为了研究证实Tca8113细胞高表达CXCR4受体，从基因水平来检测Tca8113细胞表面CXCR4的表达。通过应用逆转录PCR，基因水平检测CXCR4受体mRNA发现，4组均表达CXCR4受体mRNA，刺激组最高，抑制剂AMD3100预先干预组表达量最低。这说明正常的Tca8113细胞表面表达CXCR4受体，在CXCL12的相关作用下，肿瘤细胞表达的CXCR4mRNA及其翻译表达的蛋白质都相应的高表达，证实了CXCR4受体在Tca8113细胞的高表达，为本实验研究奠定了一个坚实的实验基础。同时本实验也观察到单独应用AMD3100对CXCR4受体的表达无明显抑制作用，关于此方面的研究还很少，还需进一步的研究探讨。

Muller等［5］发现，趋化因子 CXCL12可以促使高表达CXCR4受体的涎腺腺样囊性癌细胞定向迁移。邱际华等［8］对鼻咽癌细胞的研究结果示:CXCL12对鼻咽癌的侵袭转移具有促进作用，同时这种促进作用可以被CXCR4受体的特异性拮抗剂AMD3100所抑制。Kajiyama等［9］的研究显示 CXCL12/CXCR4生物学轴对卵巢癌和乳腺癌细胞的生长及转移起非常重要的作用，而AMD3100则能够明显抑制肿瘤细胞的转移。

本实验通过Transwell小室及应用Matrigel构建与天然基底膜的结构十分相似人工基底膜，具有侵袭能力的肿瘤细胞在下室的趋化因子诱导下穿过滤膜，模拟了肿瘤细胞在机体内侵袭基底膜的过程来研究探讨该学轴对Tca8113细胞侵袭性的影响。100 ng/ml的CXCL12因子是能促进Tca8113细胞增殖的有效浓度［10］;本实验研究显示一定浓度的 CXCL12因子对Tca8113细胞的侵袭转移具有促进作用，CXCL12因子刺激组，其穿过小室膜的细胞数目多于对照组，同时应用AMD3100预先干预组［10］，其穿过小室膜的细胞数目少于空白对照组，说明CXCL12因子对Tca8113细胞的侵袭转移的促进作用可以被CXCR4受体的拮抗剂所抑制，说明CXCR12因子对Tca8113细胞的侵袭转移的促进效应是通过CXCR4受体来介导实现的。由此我们认为，淋巴结、肺组织等这些容易发生转移的器官，其可能高表达CXCR4受体，恶性肿瘤细胞在趋化因子的趋化牵引作用下，逆浓度梯度出现器官特异性转移。关于Tca8113细胞的具体的器官特异性迁移机制还不甚明了，还需进一步研究证实。AMD3100作为CXCL12因子的特异性拮抗剂，其可以竞争性阻断CXCL12因子与CXCR4的结合，从而阻断CXCL12/CXCR4生物学轴的信号传导通路，导致了Tca8113细胞侵袭转移能力的减弱。

综上所述，本实验中利用一定浓度的CXCL12因子及其抑制剂AMD3100，作用于体外培养的Tca8113细胞，证明了CXCL12/CXCR4生物学轴在肿瘤细胞体外侵袭转移方面中发挥着重要的促进作用。关于CXCR4受体的抑制剂AMD3100，其阻断CXCL12/CXCR4生物学轴的具体机制，以及其作为一种新的有望成为抗肿瘤转移的药物，其作用机制及应用前景还需要进一步的研究和证实。

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