等离子体对基托树脂表面白色念珠菌生物膜的杀灭研究

乔春元 马小青 钱梦珂 谢海峰 张怀勤

近年来随着乙肝、丙肝和艾滋病等的发病率增加，交叉感染已成为口腔医学中亟待解决的问题。患者口腔唾液和血液可污染医疗器械和一些不易消毒的物品，如修复体、印模和石膏模型［1］，可摘义齿制作、调改、修理和重衬过程中，可造成交叉感染。义齿消毒常采用化学浸泡法，然而有报道化学消毒剂会导致义齿基托表面色泽改变、微孔形成和表面粗糙度增加［2－3］，并且对生物膜的灭活不够充分［4］。低温等离子体具有杀菌快速，高效，无化学残留物，仅作用于材料表层对材料本体性能没有影响等特点。前期已采用等离子体技术对印模表面乙肝病毒、石膏模型表面金黄色葡萄球菌进行杀灭研究，均取得良好效果。本研究比较氩气、30%H2O2和50%H2O2等离子体对基托树脂表面白色念珠菌生物膜的杀灭效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

固化型义齿基托树脂(日进中国昆山合资公司);国际标准菌株白色念珠菌(ATCC90028，南京便诊生物科技有限公司);50%过氧化氢(南京康克化工有限公司);30%过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司);HPD－2400次大气压辉光放电低温等离子体表面处理机(南京苏曼电子有限公司);全自动菌落分析仪(Interscience，Scan200，法国);扫描电子显微镜(LEO，1530VP，德国)。

1.2 基托试件制备

按厂商说明使用基托树脂制成9mm×9mm×2 mm的PMMA试件68块，表面用600、800、1000目砂纸沿同一方向打磨，实验前试件先蒸馏水清洗，后超声振荡20min，并在紫外光下正反面分别照射20min灭菌备用。

1.3 生物膜培养

将复苏的白色念珠菌接种于沙堡培养基，于37℃恒温培养箱中培养。连续传2代后，取培养物于酵母浸出粉胨葡萄糖培养液(YeastExtractPeptoneDextrose，YPD)中增菌培养20h，将增菌产物离心(5000 r/min，4℃，5min)，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。PBS重新悬浮，细菌比浊仪测定MCF(麦氏浊度单位)值为0.333，制备每毫升约含1.0×108菌落形成单位(CFU)的菌悬液。试件在PBS液中浸泡2h，放入24孔板，每孔加入2ml菌悬液，37℃培养2h，吸出菌悬液，每孔加入2mlYPD液，置于37℃培养箱内，每24h换液1次，培养48h后取出，用PBS漂洗2次。

1.4 等离子体处理

取64块试件，随机分为16组，每组4块试件(n=4)。氩气等离子体处理组共5组，用氩气等离子体分别处理60、120、180、240、300s;30%H2O2等离子体处理组共5组，用30%H2O2等离子体分别处理20、40、60、80、100s;50%H2O2等离子体处理组共5组，用50%H2O2等离子体分别处理20、40、60、80、100s。辉光放电时电压220V，电极距离55mm，电流1.5～1.8A。氩气等离子体处理时，标本放于处理基台上，用真空泵将气压调至1800～2000Pa后，通入氩气(流量500ml/min)至大气压后，用真空泵再次调压至1800～2000Pa，辉光放电。30%H2O2和50%H2O2等离子体处理时，将标本和1ml30%H2O2(或50%H2O2)溶液放于处理基台上，真空泵调压至1800～2000Pa，辉光放电。

1.5 洗脱计数

处理后的试件用2mlPBS液超声震荡清洗，取200μl菌液系列稀释、涂板，37℃培养48h，全自动菌落分析仪计数菌落形成单位。取每组存活菌量平均值，评估3种等离子体对试件表面生物膜的杀菌效果。参考欧洲标准EN1275－2005，处理后真菌数量减少＞4log10CFU(即杀灭率＞99.99%)视为有效。杀灭率计算方法为:(对照组存活菌量－实验组存活菌量)/对照组存活菌量×100%。

1.6 扫描电镜分析

剩余4块试件取1块为对照组，其余3块分别用氩气、30%H2O2和50%H2O2等离子体处理300s，戊二醛固定、乙醇梯度脱水、冷冻干燥、喷金，扫描电镜下观察细胞形态。

2 结果

2.1 3种等离子体杀菌效果

30%H2O2等离子体处理 100s(表 1)、50%H2O2等离子体处理80s(表2)，对生物膜内白色念珠菌的杀灭(＞99.99%)即可达到欧洲标准的要求;而氩气等离子体需处理300s(表3)才能有效杀灭白色念珠菌。

2.2 扫描电镜分析

对照组(图1A)生物膜内的白色念珠菌形态正常，菌体饱满，表面平滑。氩气等离子体处理300 s后(图1B)，细胞膜完整性破坏，有孔洞。30%H2O2等离子体处理300 s后(图1C)，细胞形态变化明显，胞膜皱缩，表面粗糙。50%H2O2等离子体处理300 s后(图1D)，细胞中央凹陷，周边皱褶，孔洞增大，丧失正常形态。

表1 30%H2O2等离子体对白色念珠菌生物膜的杀菌效果(n=4)Tab1 Thefungicidalefficacyof30%H2O2plasmaagainstCandidaalbicansbiofilms (n=4)

表2 50%H2O2等离子体对白色念珠菌生物膜的杀菌效果(n=4)Tab2 Thefungicidalefficacyof50%H2O2plasmaagainstCandidaalbicansbiofilms (n=4)

表3 氩气等离子体对白色念珠菌生物膜的杀菌效果 (n=4)Tab 3 The fungicidal efficacy of argon plasma against Candida albicans biofilms(n=4)

3 讨论

A:对照组;B:氩气等离子体处理300 s;C:30%H2O2等离子体处理300 s;D:50%H2O2等离子体处理300 s图1 白色念珠菌生物膜扫描电镜图像 (×20 000)A:Control group;B:After 300 s of argon plasma treatment;C:After 300 s of 30%H2O2 plasma treatment;D:After 300 s of 50%H2O2 plasma treatmentFig 1 The SEM images of Candida albicans biofilms on the resin (×20 000)

可摘义齿使用后表面会形成生物膜，75%佩戴义齿患者的生物膜内会定植白色念珠菌［4］，近65%的患者罹患义齿性口炎，患者常诉有烧灼、味觉减退等不适感［5］。义齿性口炎影响患者的生活质量，经抗真菌治疗后仍有很高的复发率［6］。国内外许多学者正在研究白色念珠菌与白斑发生及癌变的关系。有研究报道［7］白色念珠菌可能通过抑制NOD1信号通路减少白斑组织中人β－防御素的表达。多数微生物并非以浮游状态方式生长，而是不同种属的微生物分泌胞外基质促进细菌黏附、聚集［8］，共同定植于载体表面，形成高度组织化、系统化的生物膜(菌斑)。生物膜中的微生物对抗菌药物的耐药性可高达其在浮游状态时的1 000 倍以上［5］。Théraud 等［9］比较了 6 种化学方法对白色念珠菌生物膜的杀灭效果，发现只有0.5%氯己定溶液能有效杀灭生物膜内白色念珠菌。但氯己定有致基因突变、过敏反应及神经毒性等副作用［10］。次氯酸盐浸泡后，树脂的挠曲强度降低，承受咬合力时义齿易折裂［11］。本实验采用等离子体对树脂表面白色念珠菌生物膜进行灭活研究，取得了较为满意的结果。氩气等离子体处理300 s，白色念珠菌数量减少＞4 log10CFU，杀灭率＞99.99%，达到欧洲标准的消毒要求。Matthes等［4］采用氩气等离子体对基托表面的48 h白色念珠菌生物膜处理600 s后，对生物膜内白色念珠菌的杀灭为4.12 log10CFU，与本实验的结果一致。而30%H2O2等离子体处理100 s、50%H2O2等离子体处理80 s，即可达到消毒的标准。在等离子体杀菌过程中，等离子体产生的活性成分起主要作用，如臭氧、原子氧、超氧根、羟基自由基、一氧化氮、过氧化氢等［12］。氩气等离子体较30%H2O2和50%H2O2等离子体中的活性氧成分含量低，故相同处理时间，30%H2O2和50%H2O2等离子体的杀菌效果较氩气等离子体强，Hury等［13］亦有类似报道。与浮游菌相比，同种菌的生物膜需要等离子体处理更长时间才能灭活［14］。随着处理时间的延长，等离子体渗入并损伤具有复杂结构的胞外基质，产生类似酶降解的作用，从而破坏生物膜的三维结构［15］。生物膜丧失屏障作用后，生物膜内的细胞更易于杀灭［15］。等离子体中的活性氧成分蚀刻细胞壁，暴露并破坏细胞膜［12］。Kvam等［16］研究发现等离子体穿通细胞，导致细胞内容物释放，继而在细胞外发生DNA和蛋白质的损伤及细胞溶解。这与本研究SEM结果一致，图像显示等离子体处理后白色念珠菌细胞皱缩，出现孔洞、裂隙，完整性丧失。

本研究结果表明3种等离子体组均能有效杀灭树脂表面生物膜内的白色念珠菌。30%H2O2和50%H2O2等离子体组的杀菌效果优于氩气等离子体组。在以后的研究中将进一步采用等离子体对细菌、病毒等微生物进行实验室及临床杀灭研究。

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