TNF-α调控牙周膜干细胞骨向分化中LncRNA的差异表达

崔诗曼 张清彬 左志向 曹威 赖世翔

口腔颌骨缺损或吸收常伴有局部炎症反应，其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是公认的炎症因子，亦是造成组织破坏的主要因素，影响骨组织的再生［1］。

近年来长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，虽不直接参与蛋白质的编码，但可通过表观遗传、转录、转录后等途径调控靶基因的表达［2］。已有研究分析骨髓间充质干细胞、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)骨向分化中LncRNA的表达特征［3－4］，证实 LncRNA 与细胞分化机体发育有着密切联系。而TNF-α作用下PDLSCs骨向分化中 LncRNA的表达特征，目前还未见报道。本研究旨在探究TNF-α对PDLSCs骨向分化的作用，并应用高通量测序技术分析其中LncRNA的差异表达情况。

1 资料与方法

1.1 样本来源

由本医院颌面外科门诊提供所需样本，选取18～25岁、即将正畸治疗的患者所拔除的健康第一或第二前磨牙。本研究已获得医院伦理委员会的批准(编号:000120150701)及患者的知情同意。

1.2 主要试剂

DMEM培养基、Ⅰ型胶原酶、青霉素、链霉素(Gibco，美国);胎牛血清(FBS，Hyclone，美国);β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素 C、TNF-α、茜素红(Sigma，美国);PBS溶液、兔抗鼠二抗(上海博士德公司);TRIzol Reagent(Invitrogen，美国);抗人碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)抗体、抗人骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)抗体、抗人核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor2，Runx2) 抗体(Abcam，美国);高通量测序由深圳恒创基因科技有限公司测试完成。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及分组 将拔除的新鲜牙齿样本迅速置于培养液(90%DMEM、10%FBS、100 μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素)内浸泡。于超净台内用PBS冲洗，刀片刮取根中下1/3的牙周膜，剪碎，1 000 r/min离心5 min。弃上清，加入Ⅰ型胶原酶(3 mg/ml)1 ml，吹打混匀，37℃水浴45 min。取出后加入培养液终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，1 ml培养液重悬细胞，接种于细胞培养瓶内。置于 CO2(5%)、37℃的细胞孵育箱，2～3 d更换培养液。传至第3代作为实验用细胞。实验组:加入TNF-α(10 ng/ml)［5］的成骨诱导液培养;对照组:单纯成骨诱导液培养，包括DMEM(90%)、FBS(10%)、青霉素(100 μg/ml)、链霉素(100 μg/ml)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、地塞米松(100 nmol/L)及维生素 C(50 μg/ml)。培养至不同时间点获取细胞，进行后续检测。

1.3.2 茜素红染色及定量 连续培养21 d，吸除细胞培养液，用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定20 min，吸去多聚甲醛，PBS洗涤3次，加入茜素红染液，室温静置30 min，吸去茜素红，PBS洗涤2次，显微镜下观察并拍照。吸去PBS，加入氯化十六烷吡啶1 ml，室温静置15 min，于540 nm波长下对溶液的吸光值(A)进行测定。

1.3.3 RT-PCR检测 连续培养7 d，采用酚 －氯仿提取法提取2组细胞总RNA，根据Prime ScriptTMRTPCR Kit”及“SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明完成RNA的反转录和荧光实时定量PCR测定。检测相关成骨基因ALP、OCN及RUNX2，内参为GAPDH，引物由上海捷锐生物工程公司设计合成(表1)。

1.3.4 Western blot检测 连续培养7 d，提取2组细胞总蛋白，经Bradford蛋白浓度试剂盒及BAC蛋白定量试剂盒对样品进行检测定量，按1∶3的比例加入蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，置于－80℃冰箱待用。制备SDS-PAGE胶，依照蛋白分子量大小进行电泳、转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，洗膜后加入一抗，4℃静置过夜。次日洗膜后加入二抗，4℃静置2 h，洗膜后于暗室中将ECL荧光剂滴置转移膜上，最后进行显影定影及曝光。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

1.3.5 高通量测序分析 连续培养7 d，选择酚－氯仿提取法提取细胞总RNA，质检合格后样本送检。利用Illumina PE150进行转录组范围内第二代高通量测序。根据 LncRNA的测序结果，经折叠倍率(Fold change，FC)筛选出差异表达显著的LncRNA，参数选择标准为P＜0.05，FC≥2或≤－2。

1.4 统计学处理

各实验均设置3个生物学重复，并平行处理3次。数据的分析使用SPSS 17.0，采用单因素方差分析，不同组别间的差异性分析使用t检验，当P＜0.05时表示结果具有统计学差异。

2 结果

2.1 细胞的分离培养

PDLSCs培养5～10 d后，显微镜下见细胞沿着组织块4周生长，呈放射状、贴壁生长;培养7～14 d后细胞开始融合;传代之后呈快速增长趋势，3～5 d后融合度大概为90%。细胞鉴定已于前期实验完成［6］。

2.2 TNF-α对PDLSCs骨向分化作用的影响

分别对2组细胞进行茜素红染色，并于倒置显微镜下观察，见细胞基质内有矿化结节形成，呈红褐色、散在分布。与对照组相比，实验组生成的结节面积更小、颜色更浅(图1A、1B)。这与矿化结节的定量检测结果一致(图1C)。在后续RT-PCR和Western blot实验中，实验组相关成骨基因和蛋白的表达均明显低于对照组(图2～3)。说明TNF-α抑制PDLSCs的骨向分化能力。

2.3 TNF-α调控PDLSCs骨向分化中差异表达的Ln-cRNA

测序结果的散点图显示两组样本差异基因的分布情况，红色点为有统计学意义的差异表达的LncRNA(图4)。其中差异表达显著上调的有57条，显著下调的有26条。分别选取差异表达显著上调的2条LncRNA(LINC00473、GK-AS1)和显著下调的2条LncRNA(SGOL1-AS1、ZNF385D-AS1)(表 3)，利用RT-PCR技术进行验证，验证结果具有较高的一致性 (图5)。结合miRcode注释分析发现，LINC00473位于人类第6条染色体上，为miR-23a等microRNA的前体。

A:对照组(×40);B:实验组(×40);C:茜素红染色定量图1 茜素红染色及定量A:Control group(×40);B:Test group(×40);C:Quantification analysisFig 1 Alizarin red staining and quantification analysis

图2 相关成骨基因的表达Fig 2 Expression of osteogenesis relatied gene(RT-PCR)

3 讨论

自PDLSCs发现以来，国内外很多研究已在体内或体外证实了其骨向分化能力，能促进骨组织再生［7－8］，而干细胞的骨向分化能力很可能受炎症环境影响［9］。TNF-α在牙周炎骨丧失过程中扮演着重要作用，并参与启动炎症反应［10］。在本研究中，我们通过茜素红染色、RT-PCR、Western blot检测，证实了TNF-α对PDLSCs骨向分化能力的抑制作用。

图3 相关成骨蛋白的表达Fig 3 Expression of osteogenesis relatied protein(Western blot)

PDLSCs骨向分化作用受多种因素调控，包括生长因子(TGF-β 等)、转录因子(Runx2、NF-κB 等)、细胞因子 (IL-6、IFN-γ 等)、机制通路 (Wnt/β-catenin、BMP)以及 microRNA 等［11－13］。以上机制的研究已有显著进展，而近期有学者发现，lncRNA与人类的成骨进程密切相关［14］。Jia 等［4］证明 LncRNA-ANCR 是PDLSCs增殖和骨向分化的关键调控因子。

表2 差异表达显著的LncRNATab 2 Differential expression of LncRNA

图4 差异表达的LncRNA分布情况Fig 4 Distribution of differentially expressed LncRNA

图5 RT-PCR验证测序结果中LncRNA表达趋势Fig 5 Comparison between sequencing data and RT-PCR result for LncRNA

本研究采用高通量测序技术，探索TNF-α调控PDLSCs骨向分化过程中lncRNA的差异表达。结果显示，差异表达显著上调的lncRNA有57条，显著下调的有 26条，说明 lncRNA与 TNF-α作用下的PDLSCs骨向分化具有相关关系。同时通过miRode注释分析发现，差异表达显著上调的lncRNA:LINC00473为miR-23a等microRNA的前体。有研究发现miR-23a可通过抑制 Runx2的翻译来抑制成骨分化［15］。而lncRNA可作为microRNA的前体进一步加工处理成为成熟的microRNA，进而抑制基因的表达［16］。基于以上背景，我们提出假设，LINC00473可能参与抑制PDLSCs的骨向分化，但具体机制尚需进一步验证。本研究为探索TNF-α调控PDLSCs骨向分化的机制研究提供新的靶点和方向，为颌面部骨组织缺损修复提供理论依据。

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