LncRNA-7460调控炎症来源牙周膜干细胞成骨分化的研究

徐悦蓉 邹宛桦 秦文 王丽颖 刘佳 金作林

人牙周膜间充质干细胞(human periodontal mesenchymal stem cells，hPDLSCs)是一种特异来源于人牙周组织的间充质干细胞，是修复牙周缺损的细胞来源［1］。但是，炎症微环境下的 hPDLSCs(periodontal mesenchymal stem cells from periodontitis patients，PPDLSCs)的成骨分化能力明显下降［2－3］。探索影响PPDLSCs成骨分化的因素，提高其成骨分化潜能，成为研究的方向。近年发现，长链非编码RNA(long noncoding RNAs)可能参与骨形成调控［4］。

实验组前期研究采用Arraystar人类LncRNA芯片(v3.0)成功的筛选出了健康微环境来源的牙周膜间充质干细胞(periodontal mesenchymal stem cells from healthy microenvironment，HPDLSCs)与 PPDLSCs中差异表达的lncRNA［5］。本实验选取位于第7号染色体19159555～19161539，长度为 692 bp的 lncRNA7460为研究对象。在细胞水平观察其调控能力，为改善PPDLSCs成骨分化能力，发展牙周再生治疗探寻新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和仪器

1.1.1 主要实验试剂 胎牛血清、α-MEM 培养基(Gibco，美国);0.25%胰蛋白酶、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松、I型胶原酶、茜素红、Polybrene(Sigma，美国);Trizol Reagent Life(Technologies，美国);RNase A(Invitrogen，美国);PrimeScriptTMRT Master Mix(TAKARA No.RR036A，美国);SYBR(TAKARA No.RR820A，美国);引物(上海锐博公司);lncRNA-7460过表达、抑制慢病毒、Enhanced Infection Solution(上海吉凯基因公司);碱性磷酸酶测试剂盒(南京建成生物有限公司);碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天)。

1.1.2 主要实验仪器 YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂);二氧化碳恒温孵箱(Forma，美国);倒置相差显微镜及照相系统、倒置荧光显微镜(Olympus，日本);离心机(Kubota2l00，日本);紫外线分光光度仪(Eppendorf，德国);Real-time PCR(Applied Biosystems，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 选取 HPDLSCs、PPDLSCs样本，原代培养 自10位31～41岁的健康志愿者取得HPDLSCs的牙齿样本，PPDLSCs牙齿样本取自28～40岁的10位慢性牙周炎志愿者，牙槽骨吸收大于根长1/2。离心收集根中1/3牙周膜组织块，I型胶原酶37℃消化1 h。含10%胎牛血清的α-MEM于37℃、5%CO2条件孵箱培养。原代细胞培养至细胞融合达80%时，低密度传代。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应 据Trizol试剂说明抽提细胞总RNA，控制RNA浓度在300～500 ng/μl，A260/A280为1.8 ～2.0。据试剂说明书反转录生成cDNA，进行qPCR检测。qPCR反应条件:预变性:95℃，30 s，1 Cycle;PCR反应:95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 Cycles;融解曲线分析:95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s。实验所用引物序列如表1所示。

1.2.3 lncRNA-7460过表达、抑制慢病毒转染至细胞lncRNA-7460过表达、抑制慢病毒委托上海吉凯基因化学技术有限公司构建，根据转染说明行PPDLSCs转染。3 d后倒置荧光显微镜观察，提取细胞RNA，RT-PCR验证转染效果及成骨基因表达情况。行成骨诱导，7 d后分别行RT-PCR验证成骨基因表达情况、ALP染色及活性检测。成骨诱导21 d行茜素红染色及定量测定。

1.2.4 成骨分化试验及茜素红染色 成骨培养液:含10%胎牛血清α-MEM培养基，加 β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸 50 g/ml、地塞米松 1 × 10 mol/L。PPDLSCs成骨培养第1、7、14、21天提取细胞总RNA，21 d开始茜素红染色;茜素红染液:1 g茜素红溶于100 ml蒸馏水。成骨诱导21 d PPDLSCs，多聚甲醛(4%)于室温固定，茜素红染液染色20 min。观察并定量分析;茜素红定量:六孔板每孔加入1.0 ml SDS。30 min后，吸取0.10 ml于520 nm分析吸光度。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.5 ALP染色以及 ALP活性测定 多聚甲醛(4%)于室温固定成骨诱导7 d的PPDLSCs，ALP染液染色，37℃，5%CO2，30 min避光孵育后观察;成骨诱导7 d的PPDLSCs破碎，与ALP活性测定工作液一起加入96孔板，37℃，5%CO2孵育30 min，加显色液。酶联免疫检测仪520 nm检测样品吸光度，记录数据。

1.3 统计学分析

数据均以珋x±s表示，用SPSS 13.0软件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)进行处理。单向方差分析法分析数据，P＜0.05表示统计学上存在显着性差异。

2 结果

2.1 确定 lncRNA-7460为 PPDLSCs成骨分化相关lncRNA

据本研究组前期基因芯片结果，选6个PPDLSCs中表达明显下调的lncRNA为筛选目标。qPCR检测成骨培养7 d后各lncRNA表达变化(图1)，发现lncRNA-7460上调10倍以上，将其作为研究目标。

图1 PPDLSCs成骨诱导7 d lncRNAs的变化Fig 1 lncRNA expression of PPDLSCs after osteogenic differentiation for 7 d

2.2 lncRNA-7460在PPDLSCs成骨分化不同时间点的表达

实验观察PPDLSCs成骨诱导1～21 d的表达情况。发现lncRNA-7460的表达在成骨诱导后的1、7 d不断升高，14、21 d的表达量虽下降，但仍高于成骨前(图 2)。

图2 PPDLSCs成骨诱导过程中lncRNA-7460的表达变化Fig 2 The expression of lncRNA-7460 at different time of osteogenic induction in PPDLSCs

2.3 lncRNA-7460过表达慢病毒感染PPDLSCs

转染3 d后，荧光显微镜可观察到PPDLSCs中绿色荧光染色(图 3A)。qPCR显示 PPDLSCs感染 lncRNA-7460过表达慢病毒后，lncRNA-7460的表达相对空病毒转染组升高达10.08倍(图3B)。

2.4 lncRNA-7460下调慢病毒可以成功转染 PPDLSCs

为筛选高效lncRNA-7460下调慢病毒，构建了3个lncRNA-7460下调慢病毒，分别是58380-1、58381-1、58382-1。转染 3 d后(图 4A)qPCR检测发现，58382-1抑制效率最高(图4B)，用于后续试验。

A:荧光显微镜观察(×200);B:量化分析图3 lncRNA-7460过表达慢病毒转染效率A:Fluorescence microscope observation(×200);B:Quantitative analysisFig 3 The infection efficiency of lncRNA-7460-overexpressing lentiviral into PPDLSCs

2.5 lncRNA-7460可以在体外培养条件下，促进PPDLSCs的成骨分化

PPDLSCs转染lncRNA-7460过表达慢病毒后，成骨培养7 d，qPCR检测成骨相关基因表达情况。3个标志基因Runx2，ALP，OCN的mRNA均明显升高(图5A)。ALP染色和ALP活性检测证明过表达组的ALP含量高于对照组(图5C、5D)。成骨诱导21 d后，过表达组形成更多的钙结节(图5C、5E)。

相反，lncRNA-7460下调组PPDLSCs的成骨相关基因下调(图5B);ALP表达量和钙结节的形成量也明显下降(图5C～5E)。

3 讨论

牙周炎是由细菌引起的牙周组织慢性感染性疾病，是导致成年人牙齿丧失的主要原因［6］。修复重建已被破坏的牙周组织的牙周再生治疗依赖干细胞，生长因子以及细胞外基质支架［7］。

hPDLSCs是一种来源于牙周膜组织的间充质干细胞，特定培养条件下可向骨组织、脂肪组织、软骨组织、神经组织等分化［1］，是再生牙周缺损最具潜力的种子细胞。但是，牙周炎症条件引起hPDLSCs的成骨分化能力下降，是牙周再生困难的重要原因［8］。Liu等［2］首次发现，从慢性牙周炎症组织中分离培养的PPDLSCs增殖能力增强，而成骨分化能力减弱。

A:荧光显微镜观察(×200);B:量化分析图4 lncRNA-7460抑制慢病毒转染效率A:Fluorescence microscope observation(×200);B:Quatitative analysisFig 4 The efficiency of lncRNA-7460-knockdown lentivirus into PPDLSCs

A、B:qPCR检测成骨相关基因;C:茜素红、ALP染色检测细胞成骨分化能力;D:ALP活性测定;E:茜素红定量图5 lncRNA-7460对PPDLSCs成骨分化的调节作用。A:Expression of osteogenic differentiation related mRNAs in PPDLSCs infected by lncRNA-7460-overexpressing lentivirus;B:Expression of osteogenic differentiation related mRNAs in PPDLSCs infected by lncRNA-7460-downregulating lentivirus;C:Osteogenic differentiation determined by Alizarin Red Sand ALPstaining;D:ALPactivity;E:Quantitative analysis of Alizarin red stainingFig 5 lncRNA-7460 promotes osteogenic differentiation of PPDLSCs

lncRNA在广泛的生物途径和细胞过程中发挥重要的调节作用，包括染色体失活［9］和分化［10］，干细胞多能性重编程［11］和细胞凋亡［12］。同时还参与了包括神经系统、心血管系统、炎症和癌症等疾病的发生发展［13－14］。许多研究认为lncRNA参与调控了干细胞成骨能力。Huang等［4］比较MSC成骨诱导分化前后的lncRNA，发现 H19可以剪切产生 miR-675，通过H19/miR-675/TGF-β1/Smad3/HDAC通路促进 MSC成骨分化。还有研究发现，lncRNA-ANCR通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路，抑制hPDLSCs成骨分化能力［15］。lncRNA-ANCR同样可以在 MSC中结合EZH蛋白，抑制关键转录因子Runx2从而抑制成骨分化［16］。

本实验组前期研究应用Arraystar人类lncRNA芯片(v3.0)，对PPDLSCs和 HPDLSCs中差异表达的lncRNA进行了分析，发现共有89个lncRNA和387个mRNA 差异表达(Change Fold ＞2，P ＜0.05)［5］。

本研究首次发现lncRNA-7460参与调控PPDLSCs成骨分化。芯片结果显示，lncRNA-7460在HPDLSCs、PPDLSCs中均有较高的基础表达，且在PPDLSCs明显下调。是否是lncRNA-7460减少导致了PPDLSCs成骨能力的下降?本实验利用qPCR检测PPDLSCs成骨诱导前、成骨诱导1、7、14、21 d的 lncRNA-7460表达，发现成骨诱导后均发生了上调;据此推测lncRNA-7460可能与PPDLSCs成骨诱导过程相关。

该研究实验设计构建了lncRNA-7460过表达和下调慢病毒，上调或下调lncRNA-7460的表达，并通过多种体外实验验证了对细胞成骨分化的影响。qPCR检测发现，PPDLSCs在成骨诱导7 d后，成骨相关基因Runx2，ALP，OCN的mRNA表达量均较成骨诱导前有明显升高。同时，lncRNA-7460上调组成骨相关基因表达水平较对照组上升更为明显，而lncRNA-7460下调组的成骨相关mRNA升高不明显。同样，ALP染色、ALP活性测定以及茜素红染色、定量等实验结果也证明，lncRNA-7460上调组成骨能力增强，而下调组成骨能力减弱。本研究证实，lncRNA-7460可在体外条件下促进PPDLSCs的成骨分化过程，lncRNA-7460能否在体内环境下调节成骨分化需要进一步实验验证。

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