性病门诊尖锐湿疣患者指尖HPV感染情况调查*

王建彬，李雪萍，曾维英，程 庆，赖嘉希，陈惠茹，柯吴坚

(1.汕头市皮肤性病防治院，广东汕头 515041；2.南方医科大学皮肤病医院，广州 510009)

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是全球最常见和最易感的性传播感染[1，2]。性接触是HPV主要的传播方式，而间接接触引起的HPV感染近年来逐渐引起重视[3]。Hernandez等[4]为研究HPV是否会通过手-性器官接触传播，他们通过随访25对HPV感染的夫妇发现，引起肛门生殖器部位疾病的HPV还可以通过手-生殖器的接触感染性伴，提示手-性器官的接触可能在HPV感染中发挥作用。Winer等[5，6]对女大学生进行观察发现，性活跃女生指尖HPV感染率为14%，如果仅有手-性器官接触而没有插入性行为女生指尖HPV感染率为10%，而没有任何性接触女生指尖HPV阳性率仅为1%，该研究进一步提示手-性器官接触在HPV感染中发挥作用。我们通过对国内外文献检索发现，目前缺乏尖锐湿疣(condylomata acuminata，CA)患者指尖HPV感染数据。为此我们通过招募性病门诊确诊为CA的患者，采用PCR方法检测其指尖HPV感染情况，来明确CA患者手指尖HPV感染情况及其在HPV传播中的意义。

1材料与方法

1.1 研究对象和样本采集 入组CA患者诊断标准根据2000年卫生部性病专家咨询委员会制定的“性病诊疗规范和性病治疗推荐方案” 并签署知情同意书。患者为2014年2月～2015年12月期间来汕头市皮肤性病防治院性病门诊和南方医科大学皮肤病医院就诊者。119例患者中男性57例，女性为62例。年龄18～64岁，平均年龄33.4岁。病程1～18个月，平均4.8个月。ACW排除标准：已经接受治疗的CA患者、HIV感染者、免疫功能低下者、长期系统服用免疫抑制剂或糖皮质激素、并发其他系统疾病和性传播疾病者或无法随访者。嘱患者避免洗手超过4 h后，用细胞刷于患者十指指尖处反复10次刷取上皮细胞，将其放入有患者编号的取样管中，取样管内已加有专门细胞保存液，拧紧瓶盖。标本采集后立即送检。4℃保存不超过24 h，-20℃保存不超过3个月。标本运送采用低温保存运送。

1.2 试剂与仪器 细胞裂解液(HybriBio公司)，Go Taq Buffer(Promega公司)，dNTP(Thermo公司)，MgCl2(Sigma公司)，Go Taq Polymerase(Promega公司)，分子水(Sigma公司)，琼脂糖(Sigma公司)，PCR扩增仪(Bio-Rad公司)。

1.3 方法 参照细胞裂解液(HybriBio)试剂操作说明提取DNA，具体方法如下：取500 μl临床样本14 000 r/min离心1 min，去上清。加入400 μl溶液I(事先45℃水浴中预热)，振荡混匀，100℃加热15 min，室温下放置2 min。点动离心，加入400 μl溶液Ⅱ，振荡混匀后，室温下放置2 min，14 000 r/min离心5 min。去上清，重复2次(务必去干净，或可将上清倒入废液缸后，14 000 r/min离心1 min，用200 μl移液器调至90 μl量，轻轻将剩余上清吸尽，枪头切勿碰到离心沉淀方向，以免吸掉DNA)。室温放置2 min，加入60 μl溶液Ⅲ，充分溶解。静置10 min，14 000 r/min离心1 min。取1～2 μl加入无菌水稀释至合适体积，用紫外分光光度计检测A260nm/A280nm值。如果核酸溶液A260 nm/A280 nm比值在1.8左右(范围介于1.7～2.0)时，认为已达到所要求的纯度，将提取好的DNA置于-70℃冰箱保存备用。PCR检测采用HPV通用引物MY09/11(MY09：5’-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3’；MY11：5’-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3’；M：A/C；R：A/G；W：A/T；Y：C/T)，引物由上海生物科技有限公司合成并经PAGE纯化。扩增HPV L1片段产物大小为450 bp。PCR反应总体系包含HPV模板DNA，上下游引物，Go Taq Buffer(Promega)，dNTP(Thermo)，MgCl2(Sigma)，Go Taq Polymerase(Promega)和分子水(Sigma)。PCR反应条件：95℃加热2 min后进入40个循环。循环条件为95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min。产物鉴定：1.5 g/dl琼脂糖(Sigma)凝胶70V电泳40 min，于凝胶成像仪中观察并记录结果。

1.4 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学分析，CA患者指尖HPV感染情况与性别比较采用卡方检验，与年龄、病程比较采用两个独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HPV DNA PCR结果 119份指尖样本中，31份HPV DNA阳性，阳性率为26.1%。HPV DNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，见图1。

注：1，2，3：阳性样本；4，5：阴性样本；6：阳性对照；7：阴性对照；M：Marker。

2.2 性别、年龄和病程对指尖HPV感染情况的影响 男性CA患者中指尖HPV感染率为29.8%(17/57)，高于女性的22.6%(14/62)，二者经卡方检验差异无统计学意义(χ2=0.808，P=0.368)。指尖HPV阳性者平均年龄为31.74±6.79岁，低于阴性者的33.98±10.36岁，二者经两个独立样本t检验差异无统计学意义(t=1.119，P=0.266)。指尖HPV阳性者平均病程为5.74±4.40月，高于阴性者的4.41±2.12月，二者经两个独立样本t检验差异有统计学意义(t=2.213，P=0.029)。结果提示CA患者的性别和年龄与指尖HPV感染无关，而与病程长短有关，时间越长感染率越高。

3讨论HPV是乳头瘤病毒家族中能够感染人皮肤或黏膜角化上皮细胞的一种约8 000个碱基对的DNA病毒[7]。HPV病毒体通过上皮组织微损伤与其受体-α整合素和层黏连蛋白结合并通过网格蛋白和/或小窝蛋白介导的内吞作用进入基底上皮细胞。全球HPV感染率高达12%[8]。目前已有170种HPV型完成基因组测序[9]，超过40种HPV型通过性行为传播[10]。HPV的传播途径包括性接触、母婴传播、密切接触、间接接触和医源性感染等。直接性行为在HPV感染中已经得到广泛证实，但对于间接接触感染，比如通过手-生殖器部位感染则研究不足。Hernandez等[4]每隔一个月对25对夫妇的生殖器和优势手进行HPV检测，平均随访7.5个月。研究发现有2对夫妇生殖器部位高危型HPV感染对方优势手，2例妻子优势手HPV传染到丈夫的生殖器，1例妻子生殖器HPV传染到丈夫的优势手，各有2例丈夫和妻子自己生殖器HPV传染到自己的手。因此笔者认为手部HPV的自身或性伴接触可能在HPV感染过程中扮演重要角色。Winer等[5]对大学女生指尖进行HPV检测发现，性活跃者指尖HPV阳性率为14%，而14例无性行为女生指尖均未检出HPV。Winer等[6]另一项针对大学女生研究显示，无插入性行为但有手-生殖器接触者指尖HPV阳性率为10%，而无任何性接触的76位女生仅1人指尖检出HPV。因此研究者认为HPV可通过感染者及其性伴的手传染到生殖器部位。

CA是由HPV感染引起的临床常见性传播疾病[11，12]，而HPV的间接感染也时有报道。为了解CA患者手部HPV感染率以及HPV是否会通过CA患者手部进行传播，我们通过对国内外文献检索发现，目前国内外缺乏CA患者指尖HPV感染数据。为此我们通过招募性病门诊确诊为CA的患者，采用PCR方法检测其指尖HPV感染情况。我们发现在119例CA患者中，有31例指尖检出HPV DNA，阳性率为26.1%，其中男性和女性HPV指尖感染率分别为29.8%和22.6%，均明显高于Winer等[5]报道的大学女生性活跃者指尖14%的HPV感染率，表明与无症状HPV感染者相比，CA患者指尖HPV感染率更高，更需要引起临床重视。此外我们对指尖HPV感染者的性别、年龄和病程进行统计分析发现：①男性CA患者中指尖HPV感染率高于女性，二者经卡方检验无统计学差异；②指尖HPV阳性者平均年龄为31.74±6.79岁，低于阴性者的33.98±10.36岁，二者经两个独立样本t检验差异无统计学意义；③指尖HPV阳性者平均病程为5.74±4.40月，明显高于阴性者的4.41±2.12月，二者经两个独立样本t检验差异有统计学意义；结果提示CA患者的性别和年龄与指尖HPV感染无关，而与病程长短有关，CA病程越长指尖HPV感染率越高。

我们该项研究首次回答了CA患者指尖HPV感染情况以及感染相关危险因素，为我们后续的夫妻间手-生殖器交叉感染、HPV型别与指尖HPV感染相关性研究提供数据支持，也为防控经手HPV感染提供理论依据。

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