慢性粒细胞白血病患者骨髓单个核细胞中CaMKⅡγ在疾病不同阶段的表达及分子机制*

张文静，郑维威，宋闿迪，朱俊锋，王保龙

(1.安徽医科大学附属省立医院a.检验科；b.血液科，合肥 230000；2.蚌埠医学院第一附属医院血液科，安徽蚌埠 233000)

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其主要特征是形成bcr-abl融合基因和费城染色体，并伴有9号和22号染色体的异位[1，2]。钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)是一种多功能蛋白酶， 包括α，β，γ和δ 4种亚基，近年的研究发现CaMKⅡγ与白血病有着密切联系，是小分子化合物小檗胺抗白血病作用的分子靶标[3，4]。本研究通过检测59例不同时期慢粒患者CaMKⅡγ的表达，并初步探讨其分子机制，为慢粒的分子诊断和治疗提供依据和思路。

1材料与方法

1.1 研究对象 59例CML病例为2017年1月～2018年1月的门诊或住院患者，年龄18～76岁。其中慢性期18例，加速期21例，急变期20例。慢粒的诊断根据《血液病诊断及疗效标准》进行[5]。慢粒细胞系来源于本院中心实验室保存，复苏待用。RPMI 1640细胞培养基购于上海生工生物工程有限公司；胎牛血清购于Biological Industries；一抗：β-catenin购于CST；p- CaMKⅡγ，CaMKⅡγ抗体购于santa公司，GAPDH购于康成生物；二抗：购于康成生物；PVDF膜购于BIO-RAD，免疫共沉淀磁珠购自北京北方同正生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：所用的慢粒细胞系均培养于含有10 ml/dl胎牛血清，1 g/dl青-链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃，5 g/dl CO2中。

1.2.2 骨髓PBMC的分离：抽取CML患者骨髓2～5 ml，室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。将稀释后的骨髓缓慢加入Ficoll液面，22℃，2 500 r/min离心20 min，离心后从管底至液面分四层。小心吸取单个核细胞层，加入3倍的PBS，洗两次。将分离后的PBMC转入新的EP管中，裂解蛋白，-80℃保存。

1.2.3 Western blot检测p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ，β-catenin的表达水平：收集细胞，冷PBS洗2遍，用M-PER(PIERCE)裂解液冰上裂解20 min，4℃条件下以14 000 r/min离心15 min，提取上清总蛋白。取等量蛋白样品，SDS-PAGE后将分离的蛋白质转移至PVDF膜上，用5 g/dl脱脂奶粉封闭后，加入按相应比例稀释的二抗，4℃孵育过夜。经TBST 洗膜除去过量的一抗，然后加入二抗，室温孵育2 h。然后进行曝光显影，以GAPDH为内参照。

1.2.4 免疫共沉淀：扩细胞达到1×108/L，加入500 μl细胞裂解缓冲液充分裂解(含蛋白酶抑制剂)，取少量裂解液用于Western blot分析，剩余裂解液加1 μg相应的抗体，4℃孵育过夜；将预处理过的10 μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃孵育6 h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3～4次；最后加入15 μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min用SDS-PAGE进行鉴定。

2结果

2.1 慢粒细胞系p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表达情况 本研究用Western blot对K562，K562/ADR，Kcl-22，Kcl-22M，KU812和KBM5六种常见的慢粒细胞系p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表达水平进行了检测，结果显示，Kcl-22和KU812的p-CaMKⅡγ表达水平较高，见图1。

2.2 CML慢性期和急变期p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表达情况 本研究对59例CML患者骨髓进行了p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的检测，结果显示，CML慢性期患者p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表达较低，甚至不表达，急变期患者p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ高表达，见图2，图3。通过比较p-CaMKⅡγ/GAPDH比值，结果发现，加速期和急变期p-CaMKⅡγ/GAPDH比值高于慢性期，差异具有统计学显著性意义(P=0.027和0.018)。

图1 六种慢粒细胞系p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ和β-catenin的表达情况 图2 慢粒慢性期患者p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ和β-catenin的表达情况

图3 慢粒急变患者p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ和β-catenin的表达情况

2.3 CaMKⅡγ引起慢粒急变的分子机制研究 本研究对一个经典的白血病干细胞分子标记物β-catenin进行了同步检测，结果发现，无论是慢粒细胞系还是CML患者骨髓样本，β-catenin与CaMKⅡγ的表达几乎是同步的，进一步通过免疫共沉淀结果也显示，在慢粒细胞系K562中，CaMKⅡγ和β-catenin存在相互作用。详见图1，图2，图3，图4。

图4 K562细胞CaMKⅡγ和β-catenin的相互作用

3讨论CML是骨髓造血干细胞恶性增殖疾病，其特点是Ph染色体的形成，在大多数CML体内可检测出BCR-ABL融合基因，通过编码酪氨酸激酶影响细胞分化[6]。 临床上在治疗CML时的一线药物有伊马替尼和达沙替尼，其中伊马替尼的应用最为广泛，已成为CML患者的常用药物之一。BCR/ABL基因突变引起ABL激酶氨基酸改变，通过直接阻断伊马替尼与ABL激酶的结合或者妨碍ABL激酶失活构象的形成而干扰药物与靶位点的结合，最终导致耐药的发生[7]。

β-catenin是Wnt信号转导通路中的核心因子，它承接上游的信号，也将信号传递至基因表达，帮助改变细胞的生长活性。研究发现，β-catenin可参与介导60多种基因表达，其中绝大多数为原癌基因，包括c-myc，cylin D1等靶基因，它们被β-catenin异常激活后，导致具有分化潜能的细胞不可控制地分化，在血液系统则可表现为造血干细胞异常克隆增殖，进而产生白血病细胞[8]。

急变期是CML的最后阶段，这一阶段病情更为凶险，治疗难度更大，其分子机制依然不是十分清楚。大量的研究表明，白血病干细胞(LSC)的自我更新和复制是CML慢性期过渡到急变期的关键分子[9，10]。之前有研究表明，CaMKⅡγ在CML干细胞中被大量激活，同时激活了β-catenin[11，12]。因此我们推测，CaMKⅡγ可能在CML慢性期至急变期是至关重要的调节分子。本研究结果显示，CaMKⅡγ在CML慢性期至急变期发挥重要作用，其表达可能与β-catenin的激活有关，且根据免疫共沉淀的结果也发现，CaMKⅡγ与β-catenin存在相互作用，但其确切分子机制尚需要更多的实验加以证明。

综上所述，CaMKⅡγ在慢粒细胞系和慢粒加速期和急变患者中呈现高表达，其分子机制可能与β-catenin的激活有关，这一研究结论将为CML的分子诊断提供重要依据。

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