基于流通池装置的新溶出方法用于尼莫地平片的一致性评价

李 辉，赵悦清，蒋妮谚含，程泽能*

(1中南大学湘雅药学院，长沙 410013；2湖南中医药高等专科学校，株洲 412012)

作为药物特性的一种检查方法，溶出检查在药物制剂研发及终产品的质量控制中发挥着重要的作用[1]。常规的溶出方法有篮法、桨法、小杯法等。然而，这些常规的方法均采用了“不同药物相同制剂使用不同条件达到相同的通用标准”这一基本模式，这种封闭的溶出系统存在若干内在缺陷：如不能模拟胃肠道内序贯性生理pH的胃肠液，不能模拟体内胃肠液的流体动力学特征，不能模拟药物在胃肠道内的动态转运过程等[2-3]，导致药物制剂的体内外溶出行为不一致，即体内外相关性(invitroandinvivocorrelation,IVIVC)差[4]，体外溶出检查往往不能够全面客观反映药物进入体内后的实际溶出行为。在生物药剂学领域，建立药物制剂体内和体外溶出/释放的相关性是一项长期的挑战。

流通池法是美国药典(USP40)收载的第Ⅳ种溶出方法。相比于其他方法，流通池溶出装置由于其特殊的结构和工作模式，可以更好地模拟药物在胃肠道内的实际溶出环境和转运条件，其在体内外相关的药物溶出研究方面有独到的优势[5]。本研究选用流通池溶出仪的开放式工作模式，通过在不同时间段序贯地使用不同的溶出条件，模拟胃肠道内的溶出环境，依据体内外相关性原理，建立了一种新溶出方法，并将其用于药物制剂体外溶出行为的一致性评价。同时，以传统的四条溶出曲线法作为对照，采用桨法溶出仪考察了实验药品在4种不同溶出介质中的溶出行为，旨在评价国内生产的试验制剂(仿制药)和国外的参比制剂(原研药)溶出行为的一致性，并考察新溶出方法与四条溶出曲线法在区分药物制剂质量差异方面的异同。

本实验选择尼莫地平片(nimodipine tablet)为研究对象，其剂型为胃溶型普通速释片，活性成分为尼莫地平。尼莫地平属于生物药剂学分类(biopharmaceutics classification system，BCS)的Ⅱ类(BCSⅡ)[6]，具有低溶解度和高渗透性，药物的体内吸收符合溶出限速，可以认为体内吸收曲线等价于体内溶出曲线，理论上能够建立IVIVC[7-8]。通过建立IVIVC，并结合药物的BCS分类和剂型特征，可以使体外溶出/释放试验更好地反映药物在体内的溶出规律和吸收情况[9-10]。基于IVIVC原理，改进现有的溶出度评价方法或开发新溶出方法，深入分析和控制国产药品与国外原研药溶出特性的差异，对于提高我国口服药物的制剂水平和质量，促进制剂工艺水平提升具有一定意义[11]。

1 材 料

1.1 药品与试剂

尼莫地平片试验制剂(规格：30 mg，批号：20170501，国内某药企)；尼莫地平片参比制剂(规格：30 mg，批号：BXN152G、BXN14AH，拜耳医药保健有限公司)；尼莫地平对照品(纯度：99.7%，批号：100270-201403，中国药品生物制品检定所)；十二烷基硫酸钠(SDS，中国食品药品检验研究院，分析纯)；其他试剂均为市售分析纯，水为超纯水。

1.2 仪 器

RC8MD型药物溶出度仪(天津天大天发科技有限公司)；HS_R650型流通池微分溶出仪(长沙宏盛电子科技有限公司)；UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；AB135-S型十万分之一天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；BS224S型万分之一天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)等。

2 方 法

2.1 溶出样品的检测

采用紫外-可见分光光度(UV)法测定尼莫地平片的溶出度，检测波长为238 nm。收集溶出样品后立即用0.22 μm的微孔滤头(尼龙膜)过滤，通过随行标准曲线计算样品中尼莫地平的质量浓度。方法学研究表明：尼莫地平在238 nm波长处有较大吸收，空白辅料和溶出介质在该波长处对主药测定无明显干扰；以各溶出介质配制的尼莫地平对照品溶液在24 h内稳定性良好。尼莫地平在纯化水(0.3%SDS)、pH 1.2氯化钠盐酸溶液(0.3%SDS)、pH 4.5醋酸盐缓冲液(0.3%SDS)和pH6.8磷酸盐缓冲液(0.3%SDS)等溶出介质中，其质量浓度在4.0～40.0 μg/mL范围内线性良好(r≥0.999)。精密度和回收率试验结果均符合定量分析的要求。由于尼莫地平具有光敏性，本实验的所有操作均在避光条件下进行。

2.2 新溶出方法

通过解析和联立尼莫地平片参比制剂的体内吸收过程和体外溶出行为，建立IVIVC并确立新溶出方法。依据参比制剂口服给药后的血药浓度数据计算其体内累积吸收百分率(cumulative absorption，Fabs，%)，以体内不同时间的Fabs作为体外溶出标准，基于流通池法溶出仪的开放式工作模式，通过试验和对比不同溶出条件(不同溶出介质、不同介质流速、不同表面活性剂浓度、不同pH等)下的累积溶出百分率(cumulative dissolution，Fdis，%)，对药物的体外累积溶出百分率-时间曲线与体内累积吸收百分率-时间曲线进行比较研究，最终使两条曲线实现重合，从而创建一种点对点的IVIVC，相应地确立出一种与体内条件相关的体外溶出方法(图1)，并用该新方法考察尼莫地平片试验制剂和参比制剂体外溶出行为的一致性。

Figure1 Development of the IVIVC and establishment of the corresponding dissolution condition related toinvivophysiological conditions

2.2.1 新溶出方法的建立

参比制剂人体药代动力学数据的获取：通过文献检索获取参比制剂口服给药(R1和R2)和尼莫地平静脉注射给药(iv)数据[12-13]，采用GetData Graph Digitizer v2.22软件分别对文献中口服和静脉注射给药的平均血药浓度-时间曲线进行图形数字化[14]，获取不同时间点的血药浓度数据。其中R1和R2分别表示不同实验周期时的给药情况。本研究中，R1的血药浓度数据被用于建立新溶出方法；R2的则被用于检验新溶出方法的体内外相关性。

体外溶出标准的制定：使用PhoenixTMWinNonlin®6.1软件对参比制剂口服给药的血药浓度数据进行房室模型拟合，选用Loo-Riegelman法解析参比制剂口服给药后的Fabs[15](公式1)，以不同时间点的Fabs作为新溶出方法的体外溶出标准。

(1)

溶出条件的摸索和确立：选用相似因子(f2)法[16-17]判断药物体外溶出曲线和体内吸收曲线的一致性，以建立体内外相关性。依据体外溶出标准，通过摸索和对比不同的溶出条件，使参比制剂的体外累积溶出百分率-时间曲线与体内累积吸收百分率-时间曲线间的相似因子(f2)大于或等于50(公式2)，即两条曲线达到一致，从而实现体外溶出行为与体内吸收过程的相关。

(2)

式中：f2为两条曲线间的相似因子，n为采样点个数，Rt/abs为参比制剂在t时间的体内Fabs，Rt/dis为参比制剂在t时间的体外Fdis。

分别选用人工胃液和醋酸盐缓冲液(含不同浓度的SDS)为溶出介质，依次采用表1所示的C1～C6 6种溶出条件，探索不同的溶出介质、流速、pH、表面活性剂浓度等变量对药物溶出过程的影响，依次在5，10，20，30，45，60，90，240 min时收集溶出样品进行检测，研究参比制剂的体外溶出行为。由于本研究选用了流通池法的开放式工作模式，只能得到药物的微分溶出数据，为便于溶出曲线的统计学比较，采用数值积分法将微分溶出数据转化为累积溶出数据(公式3)。

(3)

式中：Dissolution(%)为ti时间药物的体外累积溶出百分率；n为取样点个数；dosage为药物制剂的规格；Ci为ti时间点溶出池中药物的浓度，Flow rate为溶出介质流速。

Table1 Six dissolution conditions#(C1- C6) under exploration

ConditionDissolution mediumFlow velocity/(mL/min) Time periodC1Simulated gastric fluid(Without surfactant)2.00-20 min4.020 min-3 h2.03-4 hC2Simulated gastric fluid(Without surfactant)5.00-15 minAcetate buffer (0.2%SDS)4.015 min-2 hAcetate buffer (0.4%SDS)4.02-4 hC3Simulated gastric fluid(Without surfactant)5.00-15 minAcetate buffer (0.8%SDS)4.015 min-3 h2.03-4 hC4Simulated gastric fluid(Without surfactant)5.00-15 minAcetate buffer (0.4%SDS)2.015 min-3 h4.03-4 hC5Simulated gastric fluid(Without surfactant)5.00-15 minAcetate buffer (0.4%SDS)4.015 min-1.5 hAcetate buffer (0.6%SDS)4.01.5-4 hC6Simulated gastric fluid(Without surfactant)5.00-15 minAcetate buffer (0.6%SDS)2.015 min-1 h3.01-2 h1.52-4 h

#The test unit is just one under each condition,and all experiments are conducted at temperature of 37 °C

2.2.2 体内外相关性检验 重复溶出6片参比制剂，并计算平均Fdis。利用线性最小二乘法回归原理，以不同时间点的体外平均溶出百分率作为自变量，以文献中参比制剂(R2)相应时间的体内Fabs作为因变量，进行线性回归。依据回归系数r评价“2.2.1”项建立的新溶出方法，检验体内外相关性。

2.2.3 基于新溶出方法的溶出研究和溶出一致性评价 在新溶出方法下，分别对参比制剂和试验制剂进行溶出研究。选用非模型依赖的多变量置信区间法评价两制剂溶出曲线的相似性[18]。通过DDSolver1.0软件[19]计算参比制剂溶出数据的多变量统计矩(multivariate statistical distance，MSD)和试验制剂溶出数据MSD的90%置信区间。以参比制剂溶出量的批间差异情况为依据，确立MSD的相似性限度，并确定试验制剂和参比制剂平均溶出量的MSD及实测溶出量MSD的90%置信区间。如果此置信区间上限小于或等于参比制剂的相似性限度，则认为两制剂的溶出曲线具有相似性。

2.3 四条溶出曲线法

2.3.1 溶出曲线测定 参照《中华人民共和国药典》(2015年版)关于尼莫地平片的溶出度检查条件[20]：取尼莫地平片12片，按照桨法，依次以纯化水(0.3%SDS)、pH 1.2氯化钠盐酸溶液(0.3%SDS)、pH 4.5醋酸盐缓冲液(0.3%SDS)和pH 6.8磷酸盐缓冲液(0.3%SDS)900 mL为溶出介质进行溶出研究，转速为75 r/min，分别于5，10，15，20，30，45，60 min取溶出样品5 mL(同时补液5 mL)，采用UV法检测，并计算不同时间点的累积溶出百分率。

2.3.2 溶出行为一致性评价 选用相似因子(f2)法评价尼莫地平片参比制剂和试验制剂在各介质中溶出行为的相似性。

3 结 果

3.1 新溶出模式

3.1.1 尼莫地平的体内药代动力学数据 从文献获取的参比制剂口服给药和尼莫地平静脉注射给药的平均血药浓度-时间曲线如图2所示，其中R1和R2分别表示同一临床实验中不同实验周期时参比制剂的给药情况。R1的人体血药浓度数据被用于建立新溶出方法和体内外相关性；R2的则被用于检验IVIVC。

Figure2 Plasma drug concentration-time curves of nimodipine after administration orally (R1 and R2) and intravenously (iv)

R1 and R2 represent the human plasma drug concentration data during different pharmacokinetic experiments in the literatures respectively.R1 was used to establish the new dissolution method and IVIVC，and R2 was used to test IVIVC in this study

3.1.2 体外溶出标准 选用Loo-Riegelman法解析参比制剂的体内Fabs(表2)。以R1的Fabs作为体外溶出标准用于建立新溶出方法。

Table2Fabsversus time after orally administration of reference preparation

t/hFabs/%R1R20000.252.532.030.524.9221.560.7546.3242.21159.3754.121.572.4767.35281.0975.67390.7486.32493.1390.95

C1～C6各溶出条件下的累积溶出曲线见图3。从图3可以直观地看出，C6溶出条件下的溶出曲线与药物的体内吸收曲线最为接近。在C1～C5溶出条件下，尼莫地平片的体外累积溶出曲线与体内吸收曲线间的f2依次为11.17、25.37、38.19、47.77和47.75，均小于50；而在C6条件下，药物的体外累积溶出曲线与体内吸收曲线间f2为75.42，明显大于50，提示体外溶出条件C6与药物的体内生理溶出环境比较接近，药物的体外溶出行为与体内溶出/吸收过程具有相关性，体内外过程较为一致。

Figure3Invitrocumulative dissolution curves under the six dissolution conditions respectively (C1- C6) andinvivocumulative absorption curve of the reference preparation

3.1.3 体内外相关性检验 在C6溶出条件下，尼莫地平片参比制剂的平均Fdis与相应时间的平均Fabs间线性回归的相关系数r=0.981 8，线性较好(图4)，表明C6溶出条件的体内外相关性较好，基于流通池装置的C6溶出条件可以作为尼莫地平片的新溶出方法。

Figure4 Plot of mean cumulative dissolutioninvitroversus mean cumulative absorptioninvivofor nimodipine

3.1.4 溶出曲线测定及结果 在新溶出方法下，参比制剂和试验制剂的平均微分溶出曲线和平均累积溶出曲线见图5。溶出曲线的相似性评价，优先考虑使用f2法，但由于试验制剂第1个取样时间点的溶出量相对标准偏差超过了20%，其余取样点的相对标准偏差也超过了10%，不满足f2法的适用条件[21]，因此选用非模型依赖的多变量置信区间法评价两制剂溶出曲线的相似性。计算得出参比制剂溶出数据的MSD为16.849 5，其与试验制剂溶出量MSD的90%置信区间为：13.877 1～19.821 8。本研究所用的参比制剂仅为2个批次，因此，仅以这2个批次溶出数据的MSD作为相似性限度。结果显示MSD的90%置信区间上限明显大于相似性限度，因此，判定试验制剂与参比制剂的溶出曲线不具有相似性。

3.2 四条溶出曲线法

尼莫地平片在桨法下的溶出曲线见图6。通过桨法得到的溶出数据满足f2法的适用条件，因此，采用f2法评价参比制剂和试验制剂溶出曲线的相似性。两制剂在纯化水(0.3%SDS)、pH 1.2氯化钠盐酸溶液(0.3%SDS)、pH 4.5醋酸盐缓冲液(0.3%SDS)和pH 6.8磷酸盐缓冲液(0.3%SDS)4种介质中，平均溶出曲线间的f2依次为54.29、59.34、51.34和62.05，均大于50，表明两制剂的溶出行为基本相似。

A：Purified water (0.3%SDS)；B：pH 1.2 hydrochloric acid solution of sodium chloride (0.3%SDS)；C：pH 4.5 acetate buffer solution (0.3%SDS)；D：pH 6.8 phosphate buffer solution (0.3%SDS)

3.3 两种溶出方法的对比

3.3.1 溶出过程比较 在新溶出方法下，试验制剂与参比制剂体外溶出曲线不相似，试验制剂的溶出度显著低于参比制剂；而桨法溶出结果表明，两者在4种溶出介质中的溶出行为基本相似，溶出度无明显差异。在新方法的溶出研究中，观察发现两制剂的形态变化存在着明显的差别：参比制剂有一个快速的崩解过程，而试验制剂的崩解过程较为缓慢，直至4 h时崩解尚不完全；但是在桨法溶出过程中，两制剂形态变化的区别并不明显，均很快发生了崩解。新溶出方法的溶出过程较为平缓，没有瞬间突释现象；而桨法的溶出过程比较迅速，60 min时药物的溶出量均已达85%。在新溶出方法中，参比制剂的批内溶出重现性较好，溶出曲线几乎重合，而试验制剂的溶出重现性非常差，批内溶出数据标准偏差较大；但是在桨法中，试验制剂和参比制剂的溶出重现性均很好，体现不出上述差别。新溶出模式的研究结果表明，试验制剂和参比制剂的内在质量存在差异，试验制剂的制剂工艺可能较差，溶出不完全，并且溶出度重现性不好，而传统的桨法对于药物制剂间的这些细微差异并无有效的区分力。

3.3.2 体内外相关性比较 在新溶出方法下，尼莫地平片参比制剂溶出85%需要4 h左右的时间，这与体内实际吸收情况比较接近(表2)，其累积溶出曲线与体内吸收曲线几乎重合；而桨法中，药物在起始阶段快速溶出，到45 min时，4种溶出介质中的溶出量均已达80%，这与体内实际情况不符合。桨法得到的药物体外溶出速率显著大于体内实际吸收速率，而新溶出方法下的体外溶出速率与体内吸收速率较为接近。

为评价新溶出模式下尼莫地平片的体外溶出动力学与其体内吸收动力学的相似性，采用一级速率模型(First-order)、零级速率模型(Zero-order)和威布尔模型(Weibull)3种常用的数学模型分别对参比制剂的平均体内吸收曲线和平均体外溶出曲线进行动力学过程拟合，以拟合优度(R2)判断拟合效果(R2越接近1，说明拟合越好)。结果表明，体外溶出动力学和体内吸收动力学均不符合零级模型，而一级模型和威布尔模型均能较好地描述体内吸收动力学。对比R2得出，威布尔模型拟合效果最佳，一级速率模型次之(表3)。

分析参比制剂的体外溶出动力学和体内吸收动力学威布尔模型参数可知：体外模型参数α与体内的比较接近，参数β均大于1，表明药物的体外溶出和体内吸收过程较为一致。由参比制剂体外溶出一级速率模型参数和体内吸收一级速率模型参数可知，新溶出方法得到的体外溶出速率常数k1与其体内吸收速率常数k1基本一致。因此，从体内外相关性的角度比较两种溶出方法表明：相比于桨法，新溶出方法能更好地预测和反映尼莫地平片的体内实际溶出/吸收过程。

Table3 Fitting results ofinvitrodissolution kinetics under the new dissolution method andinvivoabsorption kinetics

Kinetic modelFunctionvitro/vivoModel parameterGoodness of fit (R2)Zero-orderF=k0×tin vivok0=0.5140.669 2in vitrok0=0.5280.679 2First-orderF=100×[1-Exp(-k1×t)]in vivok1=0.0120.967 5in vitrok1=0.0140.925 7WeibullF=100×{1-Exp[-(t^β)/α]}in vivoα=217.17,β=1.2500.978 3in vitroα=284.37,β=1.3820.949 8

4 讨 论

本研究分别通过两种溶出方法考察了尼莫地平片试验制剂和参比制剂体外溶出行为的一致性，得出了不一样的实验结果。新溶出方法表明2种制剂的体外溶出行为不相似；而四条溶出曲线法则显示相似。因为新溶出方法与体内实际情况更为接近，并且对于药物制剂间质量的细微差异有更好的区分性，理论上可以为药物制剂体内生物等效性评价提供更为有力的数据支持。因此，为提高尼莫地平片试验制剂生物等效性实验的成功率，保证其与参比制剂质量一致性，有必要对试验制剂继续进行制剂学研究，直至其在新溶出方法下的溶出曲线与参比制剂达到一致。

4.1 新溶出方法的建立

从生理学角度考虑，口服药物进入体内后的溶出、转运和吸收是一个动态连续的过程[22]，不同胃肠道部位的生理环境对于该过程会产生不同的影响。本研究所涉及的新溶出方法正是通过在不同时间段序贯地使用不同的溶出条件来动态地模拟这一过程。该方法以流通池为溶出装置，模拟了体内实际的消化道容积和消化液的含量；以单向泵入的新鲜溶出介质对药物进行溶出，模拟了药物在体内的实际溶出/转运过程和适当的漏槽条件；以层流状态的介质液流作用模拟了体内有限的胃肠蠕动和流体动力学特征，可以使药物实现平稳地溶出，因此，新溶出方法更接近体内的真实情况。

4.2 新溶出方法的区分效能

理论上，“多种pH条件下溶出曲线的测定和比对”能很好地揭示口服药物在不同体质、不同生理条件人群体内的溶出行为，是药物质量一致性评价的重要手段[23]。但是，近年来，有很多研究者提出了“即使药物制剂体外的四条溶出曲线一致，体内不一定生物等效”的观点和实例。分析原因可能为：在基于桨法或篮法溶出模式的四条溶出曲线研究中，“较大体积的溶出介质”和“较强的机械搅拌力”掩盖了参比制剂和试验制剂某些内在质量属性的差别，对此并无有效的区分力。而“较大体积的溶出介质”和“较强的机械搅拌力”也并不符合体内的实际情况。基于流通池溶出仪的新溶出方法则可以有效地避免桨法或篮法的上述缺陷。

4.3 本研究的不足之处

由于客观条件的限制，本研究存在以下不足：①未能通过人体临床试验获取参比制剂的体内药代动力学数据，本研究所涉及的人体血药浓度数据均是从已有文献中获得，而在通过Getdata Graph Digitizer软件从文献中获取数据的过程中难免引入误差；②通常验证一种IVIVC时要求将同批供试品的体外溶出百分率和相应时间的体内吸收百分率进行回归分析，而本研究所用的体外溶出数据和体内吸收数据并不是源于同批供试品，非同批产品间潜在的质量差异，可能对IVIVC的建立和验证带来影响；③本研究只采用了一种国产药品与其参比制剂做溶出特性的比较研究，结果难免存在一定的片面性，理论上应选择多家不同企业生产的试验制剂进行研究，以考察新溶出方法的工作效能。这些问题将在后期研究中进一步完善和解决。

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