人胎盘生长因子2在毕赤酵母中的表达和纯化

梁小庆，闫鹏飞，刘 煜*

(1东南大学附属中大医院，南京 210009；2中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009)

胎盘生长因子(placental growth factor，PIGF)属于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族，是一种有效的促进血管形成和增加血管通透性的诱导因子。PIGF最早从胎盘cDNA文库中分离得到，通常在滋养层、正常甲状腺以及在伤口愈合期间进行表达。它能够促进内皮细胞的增殖、迁移、分化及存活，抑制内皮细胞的老化和凋亡。PIGF在胃癌、直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和中耳胆脂瘤中明显上升，可以作为这几种肿瘤的指标性物质，说明PIGF和部分肿瘤血管生成有着密切的关系。近年来，国内外对于PIGF在促进血管生成、调节滋养细胞功能、加快缺血性疾病进程及促进肿瘤生长等方面进行了大量研究。PIGF是一种分泌性同二聚体糖蛋白，其基因定位于14q24-q31。根据编码基因RNA不同的剪接方式，目前有4种异构体：PIGF-1、PIGF-2、PIGF-3、PIGF-4，其中以PIGF-2在人体中表达最为丰富，活性最强，因此本研究采用毕赤酵母表达重组人PIGF-2蛋白，用于后续的抗体制备及活性研究。在制备中，由于PIGF蛋白具有肝素亲和活性，因此采用Heparin-Sepharose CL6B肝素亲和色谱进行高效的分离纯化。

1 材 料

1.1 质粒、菌株和试剂

Taq酶、dNTP(中国上海翊圣生物科技有限公司)；T4 DNA连接酶、EcoR I、NotI、PMD-19T、SalI(日本Takara公司)；小量质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、Lyticase(中国天根生化科技有限公司)；heparin-Sepharose CL4B(美国GE公司)；G418[生工生物工程上海(股份)有限公司]；无氨基酵母氮源(YNB，美国Difico公司)；生物素(美国Amresco公司)；PIGF抗体(美国Santa Cruzs公司)；胰蛋白胨、酵母粉(英国Oxoid公司)；人PIGF-2 cDNA (中国北京义翘神州生物技术公司)；pPIC9K、GS115、E.coliDH5α(本实验室保存)。

1.2 仪 器

电转仪、PCR仪、酶联免疫分析仪、蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像仪(上海天能公司)；琼脂糖水平电泳仪(北京六一仪器厂)；蛋白核酸检测仪(南京大学仪器厂)；数显横流泵(上海沪西仪器公司)。

2 方 法

2.1 PIGF-2基因的TA克隆

采用Primer 5设计一对PIGF-2基因的特异性引物:PI5：5′-CGGAATTCATGCCGGTCATGAGGCTGTTC-3′和PI3：5′-AAATATGCGGCCGCTTACCTCCGGGGAACAG-3′,以购得的人PIGF-2 cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR程序为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后,切胶回收与预期大小一致的条带,通过T-A克隆将其连接到pMD19-T载体上,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,均匀涂布在LB平板(含氨苄青霉素)上,37 ℃倒置培养12 h,经菌落PCR检测后挑选阳性克隆进行测序。

2.2 构建pPIC9K-PIGF-2质粒

将目的片段和pPIC9K质粒分别用EcoR I和NotI酶切，37 ℃过夜酶切，经割胶回收，T4 DNA 连接酶连接8 h，转入DH5a中，挑取阳性克隆酶切验证，将验证结果正确的菌株送去测序。

2.3 电转化pPIC9K-PIGF-2

将测序正确的菌株接种培养，提取质粒，以SalI酶切线性化，1.2%琼脂糖电泳割胶回收，-20 ℃保存。设定电转仪参数(电压1 500 V，时间4 ms)，将SalI线性化的重组质粒10 μL加入制备好的酵母细胞GS115 100 μL中，混匀，转入0.2 cm电转杯内，置电转仪，电击后取出，迅速放回冰上加入预冷山梨醇1 mL，混匀，吸取200 μL涂布于MD平板上。30 ℃培养2 d，挑取阳性克隆。

2.4 阳性克隆的筛选

将MD平板上长出的单菌落依次接种于浓度递增的G418-YPD平板上(G418质量浓度为0.25，0.5，2.0，4.0 mg/mL)，30 ℃培养2 d，挑取多拷贝阳性克隆，采用Lyticase酶解及PCR法鉴定阳性克隆。

2.5 阳性克隆的诱导表达

随机挑选阳性克隆，依次接种于YPD培养液5 mL和BMGY培养基10 mL中，30 ℃分别培养过夜。第3天室温下4 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀重悬于BMMY培养液25 mL中，加入甲醇浓度为0.5%，30 ℃振荡培养，诱导表达，连续7 d固定时间补加甲醇，第7天，8 000 r/min离心10 min，收获上清液。取上清液经SDS-PAGE电泳和ELISA鉴定。

2.6 表达条件的优化

2.6.1 甲醇诱导浓度的选择 取50 mL灭菌锥形瓶6只，按上述方法接种等量的菌液，每天按以下浓度补加甲醇：0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%，2.0%，培养7 d收集培养基，采用ELISA法测定不同诱导浓度下目的蛋白的表达量。

2.6.2 诱导时间的选择 取500 mL锥形瓶1只，接种菌液，每日按1%补加甲醇溶液，分别于诱导前及诱导后1，2，3，4，5，6，7 d取培养液1 mL留样，采用ELISA法分别测定不同时间目的蛋白的表达量。

2.7 重组蛋白的分离纯化及鉴定

酵母培养液8 000 r/min离心15 min，分离菌体，培养上清液在平衡液20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中透析平衡过夜后，过0.45 μm滤膜后上样于Heparin-Sepharose CL6B亲和柱，用平衡液和含1 mol/L NaCl的平衡液进行0～1 mol/L线性梯度洗脱，收集洗脱峰进行SDS-PAGE和ELISA检测。

2.8 ELISA检测

包被酶标板，其中加入100 μL rhPIGF-2酵母发酵液或者纯化后重组人PIGF-2样品(1 μg/mL)和100 μL包被缓冲液，4 ℃过夜。PBST洗涤后，加入封闭液(3%BSA-PBST),37 ℃ 2 h。加入一抗(将抗体以1%BSA溶液稀释)，37 ℃反应1 h后，加入HRP标记的抗鼠IgG，37 ℃反应1 h后显色。采用酶标仪在490 nm处测定样品吸收度。

3 结 果

3.1 PIGF-2基因的PCR结果

经PCR扩增后，得到PIGF-2基因，经琼脂糖电泳显示，条带位置在500 bp左右，与理论预期大小相符(图1)。

Figure1 Detection of the amplification product of human placental growth factor 2 (PIGF-2) gene by PCR

3.2 载体构建图

PIGF基因经EcoR I和NotI双酶切后条带位置正确，测序检查证明PIGF基因已成功重组于载体的多克隆位点，载体构建成功(图2)。

3.3 转化克隆的PCR检测

经PCR检测发现，转化克隆均有500 bp的阳性条带。PCR方法检测Mut+/Muts结果见图3。由图3可知，用AOX1引物(5AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′3AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)进行PCR，1、2、3、5、6、7、8号菌株均产生了1 000 bp左右和2 000 bp左右两条带，此为Mut+型菌株，而4号菌株在2 000 bp没有条带，即为Muts型菌株。

由于Mut+基因型菌株中含有AOX1基因，因此可以以甲醇为碳源，在MM平板上正常生长，而因外源基因的插入发生交换导致AOX1基因缺失的Muts却不能在MM平板上正常生长，虽然存在与AOX1具有97%同源性的AOX2基因，但其利用甲醇作为碳源的能力远远低于AOX1。

Figure2 Map of recombinant pPIC9K-PIGF-2

Figure3 Detection of recombinant plasmid pPIC9K-PIGF-2 Line 1- 8：Sample 1- 8；Line 9：Marker

3.4 表达条件的优化

3.4.1 甲醇浓度的影响 由图4可见，甲醇体积分数为0.5%时，目的蛋白的表达量最高。

Figure4 Influence of concentration of methanol on the expression of PIGF-2 inPichiapastoris

3.4.2 诱导时间的影响 由图5可见，诱导后7 d内表达量不断增加，所以将诱导时间定为7 d。

Figure5Influence of the induction period on the expression of human PIGF-2 inPichiapastoris

3.5 重组蛋白的纯化鉴定结果

由图6和图7可见，亲和色谱只有一个洗脱峰，由相对分子质量大小及Western blot结果可知，该洗脱峰为目的蛋白峰，其稳定态为二聚体，并且有少量单体存在。

Figure6 Elution curve of recombinant human PIGF-2

Figure7 SDS-PAGE and Western blot of recombinant human PIGF-2 expressed inPichiapastoris

A:Reduced;B:Non-reduced

4 讨 论

毕赤酵母表达系统既具有原核细胞的易操作性，也有真核细胞翻译后的加工能力，是重组糖蛋白比较理想的表达体系。pPIC9K载体全长9 276 bp，含有一个ColE1复制起点和两个抗性基因(Amp、Kan)，它是一个穿梭载体，既可以在原核细胞中复制，又能在真核细胞中表达，且有一个强启动子AOX1，能在甲醇的诱导下高效表达外源蛋白。所用表达菌株为GS115毕赤酵母，具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因His4，可接受含His4的载体pPIC9K而使其具有His+表型以筛选阳性转化子，因此可在组氨酸缺陷的MD平板上筛选。

由于Mut+基因型菌株中含有AOX1基因，因此可以以甲醇为碳源，在MM平板上正常生长，而因外源基因的插入发生交换导致AOX1基因缺失的Muts却不能在MM平板上正常生长，虽然存在与AOX1具有97%同源性的AOX2基因，但其利用甲醇作为碳源的能力远远低于AOX1。在筛选Mut+基因型菌株时，曾按照文献方法，从高浓度G418平板上挑取高拷贝菌株于MM和MD平板上，再观测其在平板上的生长情况，挑选在两种板子上生长一样快的为Mut+基因型。但实际情况是在挑取菌落过程中，用牙签很难把握挑取的菌量，这就很难判断菌在MM和MD平板上生长情况。因此本研究通过AOX1引物鉴定酵母染色体的基因组，由于Mut+基因型中外源重组子是通过单交换以插入的方式整合到酵母染色体中的，PCR结果应该出现酵母自身的AOX1基因条带，以及插入片段中AOX1一部分序列所产生的条带。而Muts型基因型外源基因是通过双交换的方式替换掉酵母基因组自身的AOX1基因，结果应该只出现插入片段PCR所产生的一条条带，鉴于此特征可以筛选Mut+基因型菌株。

SDS-PAGE和Western blot结果显示，表达的PIGF蛋白大部分以二聚体形式存在，少量以单体形式存在。所有阳性酵母菌株的蛋白产量都很低，探究其原因，可能是由于稀有密码子过多。如果要大量表达蛋白则需要改造基因，使其更适合酵母体系表达。

参 考 文 献

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