初发急性髓性白血病患者外周血中高表达TAL1基因及其意义*

何子凡，丘 丹，廖紫薇，陈少华，吴秀丽，李扬秋

(暨南大学基础医学院血液病研究所， 广东 广州 510632)

TAL1又称为干细胞白血病基因，是重要的调控造血分化的转录因子，属碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子家族成员[1]。TAL1表达于正常原始造血细胞中，在造血和胚胎血管发育中发挥关键调控作用，它通过调控相关靶基因的表达来影响造血细胞的发育和分化[2-3]。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)患者常见TAL1高表达，并与预后不良相关[2，4]。但TAL1在其它类型白血病,如成人常见白血病类型——急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞中表达情况并不清楚，因此，我们对初发AML患者外周血中TAL1基因的表达水平进行了定量检测。

材 料 和 方 法

1 研究对象

收集本研究所自行保存的急性白血病细胞株样本，包括T-ALL细胞株(Jurkat细胞株和CCRF-CEM细胞株)及AML细胞株(HL-60细胞株和NB4细胞株)；收集经细胞形态学、组织化学染色及流式细胞术免疫学分型确诊的47例初发急性髓性白血病患者的外周血样本(男27例，女20例；年龄20～77岁，中位年龄36.0岁)，其中包括10例AML-M1型，9例AML-M2型，9例AML-M3型，10例AML-M4型及9例AML-M5型；同时收集12例健康志愿者外周血样本作为健康对照组(男6例，女6例，年龄20～51岁，中位年龄28.5岁)。采样通过医院伦理学委员会批准，已征得患者及健康献血者的同意并签署知情同意书。

2 RNA提取和cDNA合成

收集肝素抗凝外周血样本后，常规方法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。用TRIzol试剂盒(Invitrogen)分别提取所收集的PBMCs和白血病细胞株样本的RNA，并应用随机引物和SuperScript III反转录酶试剂盒(Invitrogen)反转录合成cDNA并检测合成cDNA的质量。

3 引物设计

根据NCBI基因库的TAL1基因序列(Gene ID：6886)，分别设计上游引物(5’-GGATGCCTTCCCTATGTTCA-3’)和下游引物(5’-AAGATACGCCGCACAACTTT-3’);以β-actin作为内参照，设计其上游引物(5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’)和下游引物(5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’)。引物均由上海英潍捷基公司合成。

4 Real-time PCR

参照RealMaster Mix试剂盒(Tiangen)说明书，以β-actin作为内参照，利用SYBR Green I染料检测PBMCs中TAL1的mRNA表达水平。总反应体系为20 μL，包括2.5×RealMaster Mix(Tiangen)10 μL、0.4 mmol/L上、下游引物以及1 μL cDNA；每一标本设2个复孔。反应条件为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共30个循环;72 ℃ 5 min；在82 ℃设读板检测荧光。扩增完后，进行熔解曲线分析，以0.17 ℃ /s变化速度从55 ℃～95 ℃每隔2 s记录1次荧光值，获得熔解曲线。反应在Chromo 4实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)上进行，实验设空白对照和阳性对照。采用2-ΔΔCt法分析目的基因TAL1的相对表达水平。

5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理。计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示。采用Mann-Whitney非参数检验或Welch检验进行正常对照组与AML细胞株或AML患者外周血样本中TAL1 mRNA相对表达水平的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 TAL1 mRNA在急性白血病细胞株中的表达水平

既往研究显示T-ALL中TAL1异常高表达，因此，本实验首先检测T-ALL细胞株Jurkat和CCRF-CEM中TAL1的表达情况作为基本数据，结果显示Jurkat细胞和CCRF-CEM细胞中TAL1 mRNA的表达水平均高于健康对照组，其中Jurkat细胞的表达水平更高。我们进一步检测了AML细胞HL-60和NB4细株中TAL1 mRNA的表达水平，结果发现HL-60细胞中TAL1的表达水平明显高于T-ALL细胞株，而NB4细胞中TAL1的表达水平较健康对照组也有一定程度的增加(P<0.05),见图1。

2 TAL1 mRNA在AML患者PBMCs中的表达水平

我们进一步分析原代AML细胞样本中TAL1的表达特点，结果发现TAL1 mRNA在AML患者外周血中的表达水平显著高于健康对照组(P<0.05)。我们对不同亚型的初发AML患者PBMCs中TAL1的mRNA表达水平也进行了定量分析，结果显示初发AML-M1、AML-M2、AML-M3、AML-M4和AML-M5中的TAL1 mRNA表达水平均显著高于健康对照组(P<0.05),见图2。我们还分析了不同亚型AML患者的TAL1的表达模式，发现虽然TAL1在AML-M1和AML-M5亚型中呈现较高的水平，但是统计学分析的结果显示AML各种亚型之间的TAL1基因表达水平均无显著差异，见图2。

讨 论

TAL1基因位于1p32，首先是在1例罕见伴有t(1；14)(p32；q11)染色体易位的T-ALL中发现的，主要的遗传学改变是在1号染色体TAL1基因的5′非编码区和SIL基因之间存在一段90 kb的缺失，形成SIL/TAL1融合基因，导致TAL1高表达[5]，这种TAL1重排可见于25%～30%的T-ALL。SIL/TAL1重排与不良预后相关，高发溶瘤综合征和弥漫性血管内凝血，死亡率高，无病生存期和总生存期短。SIL/TAL1+T-ALL小鼠模型中也有类似发现[6]。在小于9岁的儿童T-ALL中，伴有SIL/TAL1阳性提示预后不良[7]。造血干细胞移植后出现SIL/TAL1融合基因阴性转阳性或者TAL1基因高表达的T-ALL患者存在早期复发，可作为移植后微小残留病变的新检测指标[8]。但是，1项来自欧洲的儿童T-ALL临床研究报道，由于SIL/TAL1伴有较多的髓外复发，382例儿童T-ALL中，16%伴有SIL/TAL1的患儿总体预后与SIL/TAL1阴性组无显著差异[9]。因此，需要从多个方面深入探讨TAL1基因与白血病发病的相关性。

Figure 1. Relative mRNA levels of TAL1 in acute leukemia cell lines (Jurkat, CCRF-CEM, HL-60, NB4) and PBMCs of healthy individuals (HI). Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsHI group;△P<0.05vsHL-60 group.

图1TAL1mRNA在健康人外周血PBMCs和急性白血病细胞株中的水平

Figure 2. Relative mRNA expression levels of TAL1 in PBMCs of acute myeloid leukemia (AML) patients and healthy individuals (HI). The short dash represents the median value.

图2TAL1mRNA在健康人和AML患者外周血PBMCs中的水平

目前对TAL1基因的研究多数集中于T-ALL中，关于TAL1基因在其它类型白血病中的表达情况并不清楚。AML是一类成人常见的恶性血液病，具有高度异质性，伴有不良细胞遗传学或分子遗传学者预后较差。为了解TAL1基因与AML发病的相关性，我们首先检测了急性白血病细胞株中TAL1基因的表达水平，发现TAL1基因不但高表达于T-ALL细胞株Jurkat和CCRF-CEM中，而且在AML细胞株HL-60和NB4中也呈高表达，甚至出现更高的表达水平，我们进一步证实了初发的原代AML细胞中TAL1基因也存在异常高表达。动物实验已证实TAL1基因的高表达可以诱导T细胞恶性转化，与T-ALL发病相关[1-2]，而TAL1在AML中的作用尚不明确。TAL1表达于正常原始造血细胞中，在造血和胚胎血管发育中发挥关键调控作用。其中，共同髓样前体细胞(common myeloid precursor，CMP)转化为粒系/单核系祖细胞(granulocyte-macrophage progenitor，GMP)的过程中依赖TAL1的参与，随着分化成熟，TAL1的表达水平下调[10]。由此，我们推测其异常高表达可能影响粒系的分化发育，参与AML的发病。TAL1的异常高表达可能是通过TAL1基因异常甲基化而介导的，有报道显示在AML小鼠模型中发现存在TAL1基因的异常甲基化[11]，也有研究发现TAL1的表达模式受TAL1基因甲基化影响[12]。这可能是有别于T-ALL的TAL1基因异常表达介导AML发生的另一种模式，但还有待进一步的证实。本研究中还发现TAL1基因在AML-M1和AML-M5亚型中呈现较高的表达水平，可能与这两种AML亚型病人的外周血或骨髓中幼稚细胞较多相关。但可能由于样本量的限制，AML各种亚型之间的TAL1基因表达水平未显示显著统计学差异，还需要进一步扩大样本量加以证实。

致谢：本文作者感谢美国佛罗里达大学医学院生化与分子生物学系Suming Huang教授对TAL1基因研究给予的指导。

[参 考 文 献]

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