西格列汀对2型糖尿病大鼠心肌细胞焦亡的影响及其可能机制*

徐 洁，杨 羚，张 萌，朱敏航，谢 芬，金晓霞，袁 琼，周乾毅

(武汉科技大学医学院新药创制研究所， 职业危害识别与控制湖北省重点实验室， 湖北 武汉 430065)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是指发生于糖尿病患者，不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其它心脏病变来解释的特异性心肌病[1]。然而，现有的药物治疗DCM的效果不佳。西格列汀(sitagliptin，SLT)是二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)的抑制剂，它能通过抑制DPP-IV降解胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的作用从而促进了胰岛素的释放，进而发挥降血糖的作用[2]。现有研究已证实西格列汀能抑制实验性2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)引起的心肌细胞凋亡、心肌肥大和纤维化[3-6]。然而，西格列汀是否具有治疗DCM的作用及其机制还有待研究。细胞焦亡(pyroptosis)是新近被认识的一种caspase-1依赖性的程序性细胞死亡方式，这种程序性死亡方式伴随着caspase-1表达上调及炎症因子白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的激活与释放并产生炎症小体[7-9]。近期研究已经证实细胞焦亡参与心脏疾病进展，提示调节细胞焦亡可能是缓解和改善心血管疾病中的治疗方向。多项研究已证实NLRP3炎症小体参与心肌细胞焦亡的发生并能促进DCM的发生与发展[10-11]；另一方面，新近研究证实，NLRP3基因沉默能抑制DCM的发生[12]，因此，NLRP3介导的细胞焦亡可能是DCM药物治疗的靶点之一。

SIRT3是高度保守的尼克酰胺依赖性Ⅲ组蛋白去乙酰化酶sirtuins蛋白家族成员，定位于线粒体，主要功能是催化线粒体应激反应蛋白去乙酰化[13]。大量研究已经确证线粒体在细胞焦亡的炎症小体激活中起着中心调节作用[14-15]; SIRT3的活化能保护心肌细胞及避免心肌病的发生[16-20]。基于这些研究，我们推测SIRT3能通过调控线粒体功能抑制NLRP3炎症小体,从而抑制糖尿病诱导的心肌细胞焦亡。

本实验研究拟利用高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的2型糖尿病大鼠模型，研究西格列汀对糖尿病心肌细胞焦亡的影响，并采用sirtuin家族抑制剂尼克酰胺(nicotinamide，NAM)探讨此影响机制是否涉及SIRT3/NLRP3炎症小体信号通路，为寻找新型治疗糖尿病心肌病的药物提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物、药物及试剂

SPF级SD大鼠，雄性，体重200～220 g，由湖北省实验动物研究中心提供(No. 42000600009018)，饲养环境清洁，室温(24±3) ℃，通风良好，自由摄食饮水。链脲佐菌素购于Sigma；尼克酰胺购于江苏碧云天生物公司；西格列汀购于Merck；血糖测定试剂盒购于南京建成生物技术有限公司；抗SIRT3和β-actin抗体购于Santa Cruz Biotechnology；抗IL-β和caspase-1抗体购于武汉三鹰公司。

2 方法

2.12型糖尿病大鼠模型的建立及实验分组 11周的SD雄性大鼠，体重200～220 g，高糖高脂饲料(含66.5%常规饲料、20% 蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇和1.0%胆酸盐)喂养8周后一次性腹腔注射STZ (用0.1 mol/L、pH 4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)35 mg/kg，1周后尾静脉采血测血糖，模型成功标准参考1999年WHO对2型糖尿病大鼠诊断标准，将随机血糖大于11.1 mmol/L定为造模成功。随机选取正常大鼠16只和成模大鼠40只进行实验分组，正常大鼠分为2个亚组：正常对照(control)组(n=8)和NAM (500 mg/kg)组(n=8)；成模大鼠随机分为5组：模型组(T2DM组，n=8)、西格列汀低剂量[SLT(L)，3 mg/kg，n=8]组、西格列汀中剂量[SLT(M)，10 mg/kg，n=8]组、西格列汀高剂量[SLT(H)，30 mg/kg，n=8]组及西格列汀(30 mg/kg)+NAM(500 mg/kg)联合用药[SLT(H)+NAM]组(n=8)。正常对照组和T2DM组给予等量生理盐水灌胃。所有大鼠均连续灌胃4周，干预期间正常大鼠继续喂食普通饲料，成模组大鼠继续喂食高糖高脂饲料，自由进水。

2.2标本的收集及检测 连续灌胃4周后所有大鼠禁食不禁水过夜，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈动脉取血，静止15 min后离心，血糖仪纸片法测定血糖，同时分别取大鼠心脏组织检测各项指标。

2.3Western blot实验 使用RIPA裂解液裂解心肌组织并提取总蛋白，SDS-PAGE分离并转膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜3次，4 ℃封闭后孵育相应目的蛋白的抗体[SIRT3(1∶2 000)、IL-β(1∶500)、caspase-1(1∶500)和β-actin(1∶2 000)]过夜。TBST洗膜3次后室温孵育 II 抗[HRP标记的抗兔(1∶1 000)和HRP标记的抗鼠(1∶2 000)IgG]1 h，洗膜3次，ECL显影。

2.4免疫组织化学染色 将心肌组织用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，采用SP法严格按照说明书操作检测SIRT3(1∶50)、caspase-1(1∶100)、IL-1β(1∶100)及NLRP3(1∶200)蛋白表达。通过柠檬酸抗原热修复， DAB显色，PBS代替 I 抗作为阴性对照。显色完毕后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明并用中性树胶封片。每个切片随机盲选5个视野分别拍照，借助Image-Pro Plus 7.0图像分析软件进行定量分析。

3 统计学处理

所有数据用SPSS 16.0软件进行统计学分析。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组均数间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 西格列汀降低2型糖尿病大鼠的血糖水平

与正常对照组相比，T2DM组大鼠血糖水平显著升高(P<0.01)；西格列汀能剂量依赖性地抑制T2DM大鼠血糖水平，且高剂量西格列汀(30 mg/kg)效果最好(P<0.05)；sirtuin蛋白家族非特异性抑制剂NAM(500 mg/kg)不能阻断西格列汀(30 mg/kg)的降糖作用，见图1。

Figure 1. The blood glucose of rats in all groups. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsT2DM group；#P<0.05vsSLT(L) group；▲P<0.05vsSLT(M) group.

图1各组大鼠血糖水平比较

2 西格列汀抑制2型糖尿病大鼠心肌焦亡

检测caspase-1和IL-1β表达水平以评价细胞焦亡的发生。结果显示，与正常对照组比较，T2DM组的caspase-1和IL-1β的表达水平均显著升高(P<0.01)；西格列汀能剂量依赖性地抑制caspase-1和IL-1β的激活表达，且高剂量西格列汀(30 mg/kg)抑制心肌细胞焦亡的效果最好(P<0.01)；NAM(500 mg/kg)能逆转西格列汀(30 mg/kg)抑制糖尿病心肌细胞caspase-1和IL-1β表达的作用(P<0.05)。与正常对照组相比，单独给予NAM(500 mg/kg)能增加正常大鼠心肌细胞caspase-1和IL-1β的表达(P<0.05)，见图2。

3 西格列汀抑制NLRP3的表达

通过免疫组化和Western blot检测心脏组织中NLRP3的表达。与正常对照组相比，T2DM组大鼠心脏组织中NLRP3水平显著升高(P<0.01)；西格列汀治疗4周后，糖尿病大鼠心脏NLRP3的表达下调且呈剂量依赖性，西格列汀(30 mg/kg)抑制NLRP3表达的效果最好；而NAM能明显逆转西格列汀对NLRP3的抑制作用(P<0.01)；与正常对照组相比，NAM(500 mg/kg)单独用药能上调正常大鼠NLRP3的表达(P<0.05)，见图3。

4 西格列汀上调心肌组织SIRT3表达

与正常对照组相比，T2DM组大鼠心脏组织内的SIRT3表达量明显下调(P<0.01)；西格列汀呈剂量依赖性上调大鼠心脏的SIRT3表达，且西格列汀(30 mg/kg)作用最强(P<0.05)；NAM(500 mg/kg)干预作用对大鼠心脏组织内SIRT3 的表达无明显作用。该结果提示西格列汀能上调糖尿病大鼠心肌细胞SIRT3表达(P<0.05)，见图4。

讨 论

糖尿病心肌病是由于心肌细胞原发性损伤引起的广泛的结构异常最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病状态。细胞焦亡是新近被认识的一种新型的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于caspase-1并伴有大量促炎症因子的释放。本实验采用免疫组织化学方法及Western blot法检测caspase-1和IL-1β表达来评价细胞焦亡的发生。实验结果显示与正常对照组比较，T2DM组的caspase-1和IL-1β表达水平均显著升高，再次验证了在2型糖尿病大鼠模型中心肌细胞发生细胞焦亡的现象。

西格列汀是DPP-IV抑制剂，一种用于治疗糖尿病的新型药物。已有研究证实心肌细胞能表达DPP-IV。目前，对西格列汀治疗糖尿病患者发生心衰的风险性评价不一。有研究人员认为西格列汀能增加2型糖尿患者心衰危险性[21]。也有研究者通过人群研究认为，2型糖尿病患者使用西格列汀后能增加其1年内心衰住院风险性，而之后却能降低其心衰的风险[22]。由此可见西格列汀对糖尿病患者心功能的作用尚不能确定。而在本研究中，西格列汀能剂量依赖性地抑制糖尿病心肌病心肌细胞焦亡的发生。本研究提示西格列汀具有抑制糖尿病诱导心肌细胞损伤的作用。然而，西格列汀对糖尿病心肌的保护作用是通过DPP-IV的直接作用还是通过GLP-1发挥作用还需要后续实验进行验证。

活化的NLRP3炎症小体是一种基于NLRP3受体寡聚而形成的大分子复合物[17-18]。脂多糖和氧化型低密度脂蛋白能NF-κB依赖性地上调胞内NLRP3蛋白和IL-1前体的表达[23-24]。NLRP3蛋白通过NACHT结构域发生自我寡聚, 借助PYD结构域与接头蛋白ASC发生相互作用，进而通过CARD结构域招募胞内的caspase-1前体，并使之发生剪切，释放出具有水解酶活性的成熟caspase-1[15]。活化的caspase-1将剪切底物IL-1及IL-18前体转变成具有促炎功能的成熟IL-1及IL-18, 并释放至胞外。而由内源性配体激活的NLRP3炎症小体已发现参与多种疾病的发生，其中包括了代谢综合征、2型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风和心脏再灌注损伤[25]。NLRP3炎症小体被认为与糖尿病诱导的多个脏器组织损伤有关。本研究发现糖尿病能诱导大鼠心肌细胞NLRP3表达上调，而西格列汀能抑制NLRP3的蛋白表达。这些结果提示西格列汀能通过抑制NLRP3依赖性的炎症小体的形成抑制心肌细胞焦亡，保护心肌。

Figure 2. The effects of sitagliptin (SLT) on caspase-1 and IL-1β expression in the cardiomyocytes of T2DM rats. A: caspase-1 expression detected by immunochemistry (×40, brown granules were positive for caspase-1 staining); B: caspase-1 detected by Western blot; C: IL-1β detected by immunochemistry (×40, brown granules were positive for IL-1β staining); D: IL-1β detected by Western blot. Mean±SD.n=8.+P<0.05，++P<0.01vscontrol group;*P<0.05，**P<0.01vsT2DM group;△P<0.05vsSLT(L) group;▲P<0.05vsSLT(M) group;#P<0.05vsSLT(H) group.

图2西格列汀对2型糖尿病大鼠心脏中casepase-1和IL-1β表达量的影响

SIRT3是高度保守的烟酰胺依赖性Ⅲ组蛋白去乙酰化酶sirtuins蛋白家族成员，定位于线粒体，其主要功能是催化线粒体应激反应蛋白去乙酰化[13]。在SIRT3缺陷小鼠模型中发现，SIRT3参与调节代谢、ATP生成和氧化应激反应等多种线粒体功能[26]。线粒体已经被认为在细胞焦亡的炎症小体激活中起着中心调节作用，大量研究已经确证不同的线粒体复合物靶向与炎症小体的信号通路[20]。本研究结果显示，糖尿病能下调心脏SIRT3的表达，而给予西格列汀能剂量依赖性地逆转心肌中SIRT3蛋白表达。同时，我们也观察到当有NAM干预存在时能上调正常大鼠NLRP3表达,促进心肌细胞焦亡，能逆转西格列汀对糖尿病大鼠心肌组织细胞下调NLRP3表达、抵抗心肌细胞焦亡的作用，但NAM并没有影响到SIRT3蛋白表达，这可能是因为NAM作为SIRT3的非特异性阻断剂，其主要作用是抑制SIRT3蛋白的活性，而不是影响其表达。另一方面，NAM+SLT(H)组和SLT(H)组实验结果比较显示，SIRT3的表达没有明显变化，但焦亡增加了，我们推测西格列汀对糖尿病大鼠心肌组织焦亡的抑制作用有可能是通过促进SIRT3表达实现的，当SIRT3活性被NAM阻断时西格列汀对焦亡的抑制作用被逆转。当然，NAM是否直接或是通过其它途径发挥抑制作用还需要做进一步探讨。这些结果提示糖尿病时SIRT3的活性或表达减少，对NLRP3的表达抑制作用被解除，NLRP3含量增加，从而促进细胞焦亡，导致DCM的发生。而西格列汀可以维持SIRT3的活性或表达，从而抑制这一过程。

Figure 3. The effect of sitagliptin on the expression of NLRP3 in the cardiomyocytes of T2DM rats. A: NLRP3 expression was detected by immunochemistry (×40); B: NLRP3 expression was detected by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsT2DM group;△P<0.05vsSLT(L) group；▲P<0.05vsSLT(M) group；##P<0.01vsSLT(H) group.

图3西格列汀对2型糖尿病大鼠心脏中NLRP3表达量的影响

Figure 4. The effect of sitagliptin on SIRT3 expression in the cardiomyocytes of T2DM rats. A: SIRT3 expression was detected by immunochemistry (×40, brown granules were positive for SIRT3 staining); B: SIRT3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsT2DM group；△P<0.05vsSLT(L) group；▲P<0.05vsSLT(M) group.

图4西格列汀对2型糖尿病大鼠心脏中SIRT3的表达量的影响

综上所述，西格列汀能抑制糖尿病诱导的心肌细胞焦亡从而抑制DCM，该作用机制可能与西格列汀上调糖尿病心肌组织细胞SIRT3活性或表达，从而抑制NLRP3的表达及细胞焦亡。然而，具体的机制还需进一步深入研究。

[参 考 文 献]

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