水蛭经炮制后的化学成分变化研究*

许石钟

河南省濮阳市中医医院中药房(濮阳 457000)

作为临床中一种传统的破血逐瘀药，水蛭粉是由水蛭炮制而成。水蛭粉主要含有蛋白质。水蛭的唾液中含有水蛭素、肝素、抗血栓素和组织胺样物质[1-2]。水蛭具有较强的生命力及再生能力，其对炮制工艺有着较高的要求，一旦水蛭未能完全处死，进入人体将会影响到患者的身体健康，甚至威胁到患者的生命安全[3]。我国《伤寒论》中最早提出采用“暖水洗”、“熬”等方法对水蛭进行炮制，且经过多年的实践发展，滑石粉汤长期以来一直是水蛭炮制的有效策略[4]。近年来，临床药学对水蛭化学成分及药理作用进行了深入的探究，并提出了水蛭生用的观点，该观点认为水蛭生用能够在一定程度上提升药物疗效，并逐渐被越来越多学者接受与认可[5]。此次研究选取我院新购进的水蛭作为研究对象，探究其炮制后氨基酸及甾体类成分变化情况，对研究结果予以如下总结与报道。

资料与方法

1 氨基酸的成分分析

1.1 仪器与条件:Beckman Coulter System Gold液相色谱仪由美国贝克曼库尔特有限公司提供，YD-L650P100-A20体积标记器购自深圳市远大激光科技有限公司，JC-8000A自动采样器由青岛聚创环保设备有限公司提供，Honeywell DT6360STC探测器由深圳市博创时空通讯技术有限公司提供，TPC170TC-A902嵌入式主板购自深圳市吉方科技有限公司。总流速以0.66ml/min为宜，缓冲液A流速一般为每分钟0.45ml，缓冲液B流速以0.23ml/min为宜。将检测波长设定为570nm，柱后反应器温度在130℃左右，柱温为53℃～75℃之间。

1.2 水蛭样品:研究所有生水蛭购自亳州市御康堂贸易有限责任公司，经过鉴定判断其为宽体金线蛭，制水蛭则是采用滑石粉对生水蛭烫制而成。

1.3 样品液的制备及水解:精密称取适量样品，在其中加入2 ml 6N盐酸溶液，放置于5 ml试管中，将试管口封闭，放置于烘箱中，将温度设置为120℃，进行水解处理，以48 h为宜。48 h后将其取出，放置入105℃环境下进行烘干，将溶剂去除，在其中加入5 ml稀释缓冲液，并反复摇晃使其混合均匀，经过0.22 u微孔滤膜实施过滤处理，此时可得到样品溶液，进样为20 μl。

2 甾体类化合物的GC-MS分析

2.1 仪器与条件:Fninigan MAT 液相色谱质谱联用仪购自广州市码斯帕科仪器有限公司，HP-1柱规格为13.0m×0.25mm ID×0.36um，实施程度升温，首次升温为100℃/min，然后保持100℃～190℃/10min，最后升温为300℃/3min。水蛭样品同1.1.2。

2.2 样品溶液制备:精密称取两种样品，每种20g，实施粉碎处理，采用95%乙醇(广州市江顺化工科技有限公司)实施回流处理，一般提取3次左右，每次2 h。对提取液实施合并，经过减压处理后将溶剂予以回收。采用5%KOH乙醇液(天津市致远化学试剂有限公司)对剩余残渣予以溶解，加热后进行为期3 h的回流处理，并对溶剂进行回收，对于剩余残渣可在其中加入适量水，采用乙醚(广州洁露华生物科技有限公司)实施反复萃取，将乙醚液进行合并，并对乙醚实施回收，采用乙醚对适量残渣进行溶解处理，可得到样品溶液，称取适量样品溶液，将其注入到气相色谱-质谱联用仪中。

结 果

1 水蛭经过炮制后氨基酸测定结果分析 经过炮制后的水蛭，其氨基酸含量如天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸等成分与炮制前比较明显降低，氨基酸总量由原来的73.95%降低到45.04%，差异较大，存在统计学意义(P<0.05)，见表1。

2 水蛭经过炮制后甾体类化合物GC-MS结果分析 甾体类化合物组成成分也发生明显变化，生水蛭中含有大量胆固醇，而经过炮制后，甾体类化合物成分未能检出，胆固醇氧化产物呈现出明显的增加趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 水蛭经过炮制后氨基酸测定结果分析 (%)

表2 水蛭经过炮制后甾体类化合物GC-MS结果分析

讨 论

生物学研究报道，作为一种雌雄同体类动物，水蛭通过异体受精，其生命力极强，但无再生能力，因此，对水蛭进行炮制时选择高温对其进行炮制[6-8]。动物类药材中含有大量的脂肪、蛋白质及甾醇等物质，其中蛋白质主要组成为氨基酸，其在生物机体代谢中有着重要的参与作用，因此在动物类药材评价中往往将氨基酸作为重要质量指标[9-10]。而所有生物体中都几乎含有甾体类化合物，其作为生物膜的重要组成部分，是激素产生的的基础，为生理活动提供了重要的物质能源。甾体化合物中含量最高的为胆固醇，其实细胞膜及血浆脂蛋白的重要组成部分[11]。而当胆固醇受到氧化其对生物功能将会产生一定的损害作用。不仅会对心血管系统产生一定的细胞毒性，造成内皮细胞死亡，而且会对细胞增殖及内皮细胞栅栏功能起到一定的抑制作用，促使弹性蛋白组成产生变化，进而导致肌动蛋白微丝破裂，对甾体合成产生抑制作用[12-13]。此次研究所选取的水蛭药材为宽体金线蛭，是我国临床中常用的动物药材品种。水蛭中含有水蛭素、蛋白酶抑制剂等多种活性多肽，其成分主要来源于吸血蛭，而宽体金线蛭则属于不吸血蛭，目前临床中尚未针对宽体金线蛭进行研究报道。对水蛭的炮制多采用的是滑石粉烫制，其温度通常在200℃以上，在这种高温条件下，水蛭药材的化学成分无疑会产生较大的变化，对胆固醇氧化产物的生产会产生一定的不利影响，进而导致胆固醇氧化产物呈现出明显的增加趋势。临床研究报道，水蛭经过炮制，其位于31KD左右的蛋白质含量将会明显增加，在22KD左右生水蛭及经过炮制的水蛭蛋白质含量均相对较高[14]。有学者在研究中发现水蛭经过炮制后未有高于45KD的蛋白质条带，这很大程度上是由于在200℃高温烫制下，水蛭中的水溶性蛋白会发生变性[15]，部分会通过自身释放蛋白酶转化为游离的氨基酸物质或小分子肽，在提取过程中，变性蛋白质将会被离心沉淀去除。此次研究中水蛭炮制后氨基酸含量明显降低，甾体类化合物组成成分也发生明显变化，且经过高温炮制，胆固醇氧化产物含量有所增加，提示水蛭炮制会在一定程度上影响到氨基酸及甾体类化合物成分的变化。综上所述，在高温炮制作用下，水蛭中的氨基酸含量及甾体类化合物成分均会受到一定的影响，应给予高度临床关注，确保水蛭药物的合理应用。

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