敏咳汤对实验性哮喘豚鼠炎性细胞、 炎性介质和细胞因子影响实验研究*

朱富华 ,王生婷,成 秋,王晓萌,颜靖棠

1.陕西省中医医院(西安 710003),2.陕西中医药大学儿科研究生(咸阳 712046),3.陕西省宝鸡市中心医院儿科(宝鸡 721000)

儿童哮喘是一种常见病、多发病，它严重地影响着患病儿童的生活质量和正常学习，近年来其发病率有不断上升之趋势，应引起我们的足够重视[1]。本文探索敏咳汤对支气管哮喘豚鼠中炎性细胞(ECP)、炎性介质(NO)和细胞因子的影响，报告如下。

材料和方法

1 材 料

1.1 实验动物:实验选择清洁级封闭群幼龄雄性豚鼠50只，购自西安市交通大学实验动物中心，动物使用许可证号：(2015)第8号，体重(200±20)g，月龄1～2月。室温在 20～25℃之间，相对湿度50%的环境中饲养两周后，将豚鼠随机分为5组，即哮喘模型组、中药大剂量组、中药小剂量组、地塞米松片对照组、正常对照组。每组各10只。用不锈钢的鼠笼分笼饲养，饮用纯净水，自然采光，以常规饲料喂养。

1.2 实验用药品:①卵白蛋白(OVA):上海世仪生物科技有限公司生产(产品货号：77121，规格：10g/瓶);②生理盐水：杭州美芙医药科技有限公司(规格：250ml/瓶)批号：120409；③地塞米松片：广州嘉禾制药有限公司(规格：0.75mg/片)，批号：1102093；④敏咳汤：蜜麻黄5g，牡蛎20g， 陈皮、蝉蜕各6g，射干、茯苓、桔梗、葶苈子、蒲公英、桑白皮、连翘、当归、前胡各10g。(本方每剂药131g相当于131g中药饮片)由广东三九制药厂有限公司提供。加热浓缩成1.27g/ml之浓度。

1.3 实验用试剂：IL-3试剂盒、IL-2试剂盒、IL-4试剂盒和IL-13试剂盒以及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)试剂盒，美国Microelisa Stripplate 公司生产，批号：20150502B。豚鼠一氧化氮(NO)试剂盒48T(产品批号YM-S2499)由上海远慕生物科技有限公司生产。

1.4 实验仪器：电子称；医用超声雾化吸入器(压缩式雾化器，上海鹿得医疗器械贸易有限公司生产)；高速冷冻离心机(德国Ken-dro公司产品)；恒温箱；自动酶标仪(美国Bio-Rad公司产品)；其他如止血钳，手术刀，注射器，灌胃针，烧杯，微量移液器，冰箱等(陕西省中医药大学第二附属医院实验室提供)。

2 方 法

2.1 造模方法：致敏阶段分别对哮喘模型组、中药大小剂量组及地塞米松组豚鼠采用腹腔注射10%卵白蛋白1ml，进行致敏。[2]正常组豚鼠以生理盐水1ml腹腔注射作为对照观察。

激发阶段：自注射第14天起，对哮喘模型组、中药大剂量组、中药小剂量组及地塞米松对照组每天上午将豚鼠置于4L雾缸内，用1%卵白蛋白溶液超声雾化20至30s,关闭机器后取出豚鼠观察症状，激发至哮喘发作(即出现烦躁不安、呼吸急促、呛咳，身体颤抖、点头及伏地现象)，连续1周，以建立哮喘模型。空白组以生理盐水代替雾化。

2.2 给药方法和途径:造模成功后(实验第28天)，清晨进行最后一次雾化，雾化90min后开始给药，正常对照组和哮喘模型组每日2次均用2.5ml生理盐水灌胃。其余两组敏咳汤组(按大剂量组：小剂量组=4∶1，敏咳汤大剂量组组加热浓缩成2.54 g/ml、小剂量组为0.635 g/ml的浓度计算)、地塞米松片对照组(地塞米松片对照组3.5mg/kg·d即给地塞米松片混悬液 0.7 mg/d)每次2.5 ml，每日2次，连续给药7 d。

2.3 标本采集:实验观察结束后，称豚鼠体重，用乙醚麻醉成功后，将豚鼠固定，常规消毒皮肤，沿颈正中线用剪刀剪开皮肤，钝性分离，暴露心脏，进行心尖部抽取全血3 ml，然后放入离心机中，以3000 r/min，离心10 min，用吸管抽吸上层血清。

豚鼠支气管肺泡灌洗液：将豚鼠于实验观察结束后称重，经腹腔注射乌拉坦麻醉成功后固定，予以皮肤常规消毒，沿颈正中线剪开皮肤,打开胸腔后分离左、右支气管，并结扎右支气管，取5号头皮针剪去针头,将其插入气管内0.5～1.0cm，同时结扎固定，连接注射器，用0.9%氯化钠注射液反复灌洗3次(10 ml/次),回吸率保持在80%左右,用离心管收集肺泡灌洗液(BALF),然后置于离心机中，以1000 r/min 离心10min后收集上清液。

2.4 指标检测:支气管哮喘豚鼠模型血清中，白介素3(IL-3)、白介素2(IL-2)、白介素13(IL-13)和一氧化氮(NO)以及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)的含量和支气管肺泡灌洗液中的白介素4(IL-4)含量均采用ELISA酶标免疫分析法测定。

结 果

1 一般状况 在实验激发前后正常对照组豚鼠的皮毛柔顺、光滑，呼吸平稳活跃，进食进水量无明显变化。哮喘激发后除正常对照组外，其余四组豚鼠皮毛没有激发前光滑、柔顺，进食进水量较前减少。哮喘激发时,各组均出现呼吸急促，喷嚏或呛咳，张口呼吸，节律不齐，身体抖动，点头、伏地，腹式呼吸较明显，甚出现口鼻及尾尖轻度紫绀，躁动不安，少部分出现休克、跌倒等现象；激发后活动明显减少或俯卧不动，状态发生改变。

2 敏咳汤对哮喘症状持续时间的影响 见表1。敏咳汤大、小剂量组与哮喘模型组相比(P<0.05)，说明敏咳汤能缩短哮喘的发作时间；敏咳汤大剂量组与地塞米松对照组无明显差异(P>0.05)，说明敏咳汤大剂量组与地塞米松组相比疗效相当；敏咳汤大剂量组与敏咳汤小剂量组相比有差异(P<0.05)，说明大剂量组疗效优于小剂量组。

3 敏咳汤对哮喘豚鼠血清中IL-2、IL-3、IL-13含量的影响 见表2。通过本次实验发现，哮喘模型组豚鼠血清中IL-2的含量水平比正常对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。敏咳汤小剂量组比哮喘模型组豚鼠血清中IL-2水平升高，但无统计学意义(P>0.05)。敏咳汤大剂量组和地塞米松组均比哮喘模型组豚鼠血清中IL-2水平升高,而且差异有统计学意义(P<0.05)。敏咳汤大剂量组和敏咳汤小剂量组相比差异有统计学意义(P<0.05)。敏咳汤大剂量组和地塞米松组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

敏咳汤对哮喘豚鼠血清中IL-3含量的影响，模型组、用药组与正常对照组相比较有差异有统计学意义(P<0.05)。用药组与哮喘模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；模型组与地塞米松、敏咳汤大剂量组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。

敏咳汤对哮喘豚鼠血清中IL-13含量的影响，通过本次实验发现，哮喘模型组豚鼠血清中IL-13的含量水平比正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。敏咳汤大剂量组、敏咳汤小剂量组比哮喘模型组豚鼠血清中IL-13水平降低,其差异有统计学意义(P<0.05)。敏咳汤大剂量组和敏咳汤小剂量组相比差异有统计学意义(P<0.05)；敏咳汤大剂量组和地塞米松组相比,差异没有统计学意义(P>0.05)。

表2 哮喘豚鼠血清中IL-2、IL-3、IL-13的变化(pg/L)

4 敏咳汤对哮喘支气管中肺泡灌洗液(BALF)IL-4含量的影响 见表3。哮喘模型组IL-4含量明显提高，哮喘模型组与正常对照组比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。地塞米松对照组、敏咳汤小剂量组、敏咳汤大剂量组与哮喘模型组比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。地塞米松对照组与敏咳汤大剂量组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。敏咳汤大、小剂量组相比，差异无统计学意义(P<0.05)。

表3 哮喘豚鼠BALF中IL-4的变化(ng/L)

5 敏咳汤对哮喘豚鼠血清中ECP、NO含量的影响 见表4。实验中哮喘豚鼠血清中ECP的变化，哮喘模型组、地塞米松对照组、敏咳汤大剂量组、敏咳汤小剂量组与正常对照组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。地塞米松对照组、敏咳汤大剂量组、敏咳汤小剂量组与哮喘模型组比较(P<0.05)。敏咳汤小剂量组与地塞米松相比较，差异有统计学意义(P<0.01)。敏咳汤大剂量组与敏咳汤小剂量组相比较(P<0.05)，差异有统计学意义。

实验中哮喘豚鼠血清中NO的变化，模型组与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。地塞米松对照组、敏咳汤大剂量组、敏咳汤小剂量组与哮喘模型组比较，有显著性差异(P<0.05)。地塞米松对照组与敏咳汤大剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。敏咳汤大、小剂量组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 哮喘豚鼠血清中ECP、NO的变化

讨 论

支气管哮喘(Bronchial asthma，简称支哮)是由多种炎症细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞)、细胞组分参与的气道慢性炎症性疾患。这种慢性炎症导致气道高反应性的增加，通常出现广泛多变的可逆性气流受阻，并引起反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间发作、加剧，多数患者可自行缓解或经治疗缓解[3]。关于哮喘发病机制，目前有：变态反应、气道炎症、气道高反应性、神经机制之说[4]。

敏咳汤是我院名老中医龚老师的经验方。龚老根据张仲景《金匮要略》曰：“咳而上气，喉中水鸡声，射干麻黄汤主之”。[5]此方是原为治疗寒证哮喘。龚老在射干麻黄汤方的启发下，别出心裁，根据儿童哮喘的病理特点化裁而来的，方中炙麻黄辛温宣肺平喘，外散风寒；连翘辛凉清热解毒，透邪外出，以炙麻黄辛温与连翘辛凉合用，体现寒温并治，针对邪易化热，共为君药。陈皮、茯苓、前胡、桔梗化痰止咳，以杜绝生痰之源；葶苈子，桑白皮，泄肺平喘，两者合用擅泄肺中痰水，以除“伏痰”之根，共达化痰止咳平喘之功，共为臣药。射干利咽祛痰散结；蒲公英既可清解火热毒邪，防止外邪入里化热化火，又可泄降滞气，以降肺之痰气壅滞；蝉衣息风抗敏，解痉平喘，缓解气管挛急，缩短病程，提高疗效；牡蛎重镇平喘，既能重镇潜阳，又可治烦躁失眠，并能拮抗长期使用中药麻黄、西药氨茶碱和β受体激动剂所引起的心脏毒性(心动过速、心律失常)等副作用；当归既能活血化瘀，改善肺部的血液循环；又可润肠通便,肺与大肠相表里,腑气通则肺气利，共为佐药。甘草调和主药，为使药。全方配伍得当，寒温并用，宣降协调，使风邪得解，伏痰以除，血活瘀化，肺气通畅，咳止痉解，哮症自平[6]。组方思想也反应了中医对哮喘治疗的不断延伸，从痰从瘀[7]，从风论治[8]。

实验结果：哮喘激发后除正常对照组外，其余四组豚鼠皮毛没有激发前光滑、柔顺，进食进水量较前减少。哮喘激发时,各组均出现呼吸急促，喷嚏或呛咳，张口呼吸，节律不齐，身体抖动，点头、伏地，腹式呼吸较明显，甚出现口鼻及尾尖轻度紫绀，躁动不安，少部分出现休克、跌倒等现象；激发后活动明显减少或俯卧不动，状态发生改变。模型建立成功。豚鼠血清中NO、ECP、IL-3、IL-13的含量和支气管肺泡灌洗液中IL-4的含量降低；血清IL-2的含量升高。

实验结果敏咳汤汤有降低血清中NO、ECP、IL-3、IL-13的含量、降低支气管肺泡灌洗液中IL-4的含量；提高血清IL-2、的含量。IL-3增进嗜酸性细胞分化、成熟、内皮细胞黏附、激活和脱颗粒，增进肥大细胞分化、成熟。IL-4和IL-13促进B淋巴细胞转化，促进IgE生成，促进肥大细胞成熟、分化，调节细胞黏附分子生成。一氧化氮(NO)高浓度时具有上皮细胞毒性作用，可以加重气道的炎性反应。嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)大量研究证实嗜酸粒细胞及其释放的细胞介质。

通过实验，可知敏咳汤从哮喘发病多个环节阻滞哮喘的发生。①从表1可知敏咳汤可缩短哮喘发生症状的持续时间。②哮喘患儿常常表现为Th1/Th2细胞因子免疫应答失衡，Th1分泌受到抑制，导致IFN-γ、IL-2等水平下降[9]。敏咳汤可升高IL-2的含量，恢复Th1/Th2类细胞因子免疫应答失衡，从而减少哮喘的发生。③敏咳汤可降低IL4和IL-13的含量，减少LgE合成的细胞因子，阻滞哮喘的发生。④IL-3在支气管哮喘发病中，一则阻滞嗜碱、肥大细胞增值和活性，二则减少嗜酸细胞活性[4]。敏咳汤可减少IL-3的含量，较少哮喘的发作。⑤敏咳汤可降低NO的含量。减少气道的炎症。这种机制在于NO能阻断嗜酸性粒细胞凋亡，从而间接加重或促进嗜酸性粒细胞炎症反应。同时作为信使的NO可抑制TH1细胞，促进TH2细胞的激活,致使激活炎性细胞的细胞因子IL-4生成过多，加重气道炎症反应，有研究表明,哮喘病人呼出气中NO含量较正常人高2～3倍，提示哮喘的呼吸道炎症与NO的大量生成有关。临床通过测定其含量，作为诊断和检测哮喘的一种指标[10]。⑥降低ECP可以减少哮喘季节性的发作，如花粉的诱发,减少气道的炎症反应。

[1] 朱富华,张瑞君,闫 玲. 中医变态反应病学[M].西安: 陕西科技出版社,2006:1-3.

[2] 汪受传,俞景茂.中医儿科临床研究[M].北京:人民卫生出版社,2009，164-165.

[3] 申昆玲. 儿科疾病临床诊疗思维 [M].北京:人民卫生出版社,2016:358.

[4] 李明华, 殷凯生,朱栓立. 哮喘病学[M].北京:人民卫生出版社,1998:83-94.

[5] 李振吉,王永炎.中医经典必读[M].北京:中国中医药出版社, 2005:124.

[6] 朱富华,姚桂芳, 冯玉章.加减射干麻黄汤治疗儿童哮喘32例及峰速值疗效观察[J]. 陕西中医,2001，23(6):487-488.

[7] 朱富华.论“亢则害，承乃制” ——变态反应病中医自亢学说[J].中医杂志，2009,49(1)：16-17.

[8] 吴兴和. 四虫祛风固本汤治疗支气管哮喘急性发作64例临床观察[J].中医杂志，2001,42(8)：476.

[9] 蒋玉红,王亚秋,孙宽周.支气管哮喘患者TH细胞的极化状态及临床意义[J].中国当代儿科杂志,2006,8(5):3379-3381.

[10] 杨 龙,张建青 .呼出气一氧化氮与哮喘相关性研究进展[J]. 海南医学,28(7)：1137-1140.