番石榴叶抑制db/db小鼠肾脏TGF-β1蛋白表达研究*

段 颖，郭翔宇，刘铜华，孙 文，许光远，董笑克，丁 雷

1．首都医科大学附属北京同仁医院传统医学科 (北京 100730)，2．北京中医药大学东方医院内分泌科(北京 100078)，3．北京中医药大学养生研究所(北京 100029)，4．首都医科大学附属复兴医院中医科(北京 100038)，5．北京中医药大学第二临床医学院(北京100078)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，DN早期症状比较隐匿，随着病情进展出现进行性蛋白尿和肾功能减退[1]，后期发展为终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)，是糖尿病患者致残、致死的主要原因之一[2]。DN早期病理改变表现为基底膜轻度增厚及系膜基质增生，肾小球滤过率升高和肾小球肥大，后期形成典型的Kimmelstiel-Wilson 结节，肾小球滤过率进行性下降[3]。前期研究中已经发现番石榴叶提取物可以降低血糖，改善胰岛素抵抗[4-5]。但番石榴叶是否有肾脏保护并不清楚。本实验将进一步观察番石榴叶提取物对db/db小鼠肾脏组织TGF-β1蛋白表达的影响，探讨番石榴叶改善肾脏纤维化的作用机制。

材料与方法

1 实验药物 番石榴叶干燥叶片购自沈阳医药集团公司大东公司，由北京中医药大学药学院药物化学实验室提取，提取工艺为：番石榴叶片粉碎后取粗粉1.1kg，用3倍量乙酸乙酯在25℃、超声50MHz的条件下提取10 min，重复共7次，过滤取药渣，用5倍量的乙醇超声提取15min/次，重复4次，留取过滤液，浓缩得浸膏。浸膏与4倍量水制成混悬液，6000 r/min条件下离心15min得上清液1；乙醇提取剩余药渣用5倍量水超声提取40min，重复2次，将两次过滤所得滤液合并，在6000 r/min的条件下离心15min得上清液2，合并上清液1、2，采用改良明胶法去除鞣质，再次过滤后滤液上聚酰胺(100～200 目)柱，依次用水洗脱，洗脱液减压浓缩，制得水浸膏64.07 g。

2 动物与饲养 16只10周龄SPF级雄性C57BLKS/J db/db小鼠，8只C57BLKS/J db/m同窝小鼠作为对照，所有动物均由南京大学模式动物研究所提供。动物在北京中医药大学动物实验中心(SPF级)饲养，饲养条件：温度(23±2)℃、湿度(55±10) %，12/12 h光照黑暗循环，自由摄食饮水，db/db小鼠予高脂饲料(购自北京科澳协力饲料有限公司)喂养，db/m小鼠喂养小鼠全价营养普通饲料(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，除实验需要空腹禁食外，其余时间小鼠均自由进食、饮水。

3 试剂与仪器 瑞士罗氏血糖仪及配套试纸；HE试剂盒，北京索莱宝生物科技公司；(30)辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG，中杉金桥公司；羊抗兔IgG/HRP，美国Sigma公司；TGF-β1抗体，美国CST公司；低温高速离心机，美国Thermo公司；BX53型光学显微镜，日本OLYMPUS公司。

4 分组与给药 所有动物适应性喂养一周后，根据小鼠体重、血糖，将db/db小鼠采用区组随机法分为番石榴叶提物组和模型组，db/m小鼠设为正常对照组，每组各8只。分组完成后按体表面积换算法分别给药，各组剂量为：番石榴叶提物组 0.11g/(kg·d-1)(相当于生药材2g/kg)；正常组、模型组每日灌服等量蒸馏水；每日固定时间灌胃1次，连续12周。

5 标本采集 干预12周后，所有小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血，离心分离血清-80℃冻存待用；颈椎脱臼法处死，迅速剖取小鼠左侧肾脏，固定于4%多聚甲醛中待用。

6 观察指标及检测方法

6.1 观察小鼠一般情况:观察并记录实验期间各组小鼠精神状态、活动情况、毛色、进食量、饮水量一般情况等，每4周记录一次体重变化。

6.2 血糖测定:分别检测各组大鼠入组前及灌胃第4周、8周、12周时血糖水平，检测前一天禁食不禁水12 h，血糖测定采用断尾检测法。

6.3 肾脏苏木素-伊红(HE)染色:取固定48h后小鼠左侧肾脏，常规石蜡包埋，切片4 μm；HE染色：石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素染色，自来水返蓝，伊红染色，1%盐酸-酒精脱色，梯度酒精脱水，中性树胶封片，光镜下观察。

6.4 肾脏免疫组化:4%中性多聚甲醛固定液中肾脏组织石蜡切片，梯度酒精脱蜡至水，0.01%Triton 37℃15min，PBS水洗3次； 抗原修复，3%H2O2孵育15min，正常山羊血清孵育 37℃15min，倾去，I抗(1∶100稀释) 4℃ 过夜；复温，PBS水洗，II抗室温孵育，DAB显色，常规脱水，中性树胶封片，镜下观察，Image-Pro Plus(IPP)软件分图片光密度值。

结 果

1 番石榴叶提取物对db/db小鼠体重的影响 与模型组相比，番石榴叶提取物对第4周db/db小鼠体重无明显影响，可以显著降低小鼠第8周、第12周体重，见表1。

2 番石榴叶提取物对db/db小鼠血糖的影响 与模型组相比，番石榴叶提取物显著降低db/db小鼠第4周、第8周、第12周空腹血糖，见表2。

表1 番石榴叶提取物对db/db小鼠体重的影响(g)

注：与对照组比较，*P<0.05

表2 番石榴叶提取物对db/db小鼠空腹血糖的影响(g)

注：与对照组比较，*P<0.05

3 番石榴叶提取物对db/db小鼠肾脏HE染色的影响 模型组小鼠肾脏组织可见肾小球扩张、球囊壁黏连，同时伴有毛细血管扩张、球旁器增生以及系膜细胞增生、并可见不同程度的肾小管扩张、颗粒样变性等病理改变；番石榴叶提取物组上述病理变化均有改善(图1)。

图1 番石榴叶提取物对db/db小鼠肾脏HE染色的影响(×400)

4 番石榴叶提取物对db/db小鼠肾脏免疫组化TGF-β1蛋白表达的影响 根据小鼠肾脏TGF-β1蛋白免疫组织化学染色图像分析平均光密度，结果显示，与模型组相比，经过12周治疗，番石榴叶提取物组TGF-β1蛋白表达显著降低，(P<0.05)，见表3(图2)。

表3 番石榴叶提取物对db/db小鼠肾脏免疫组化TGF-β1蛋白表达的影响

注：与模型组比较，*P<0.05

图2 番石榴叶提取物对db/db小鼠肾脏TGF-β1免疫组化表达的影响(×400)

讨 论

番石榴叶是桃金娘科植物番石榴(Psidium guajava Linn.)的叶及带叶嫩枝，在我国主要在福建、台湾、广东、广西、四川等地区栽培，具有燥湿健脾，清热解毒的功效，是民间用于治疗泄痢腹痛、疔疮肿毒的常用药，近年来发现番石榴叶可以治疗糖尿病。现代药理研究显示番石榴叶中的黄酮类、酚酸类，三萜和倍半萜类等化学成分具有降血糖的活性[6]。本课题组在前期的研究中发现番石榴叶水提物可以显著降低SHRSP.ZF大鼠血糖，在机制研究中发现，番石榴叶水提物通过上调肝脏脂联素受体表达，激活AMPK-PPAR-α信号转导通路，促进肝脏游离脂肪酸氧化抑制肝脏糖异生，降低空腹血糖；激活肌肉组织IRS-PI3K-AKT信号转导通路，促进骨骼肌GLUT4从细胞浆转运至细胞膜，降低餐后血糖[4-5]。

理想的动物模型是研究和防治糖尿病及其并发症的基础，db/db小鼠是目前使用最广泛的自发型肥胖型2型糖尿病模型[7]。db/db小鼠4 号染色体上的瘦素受体(LepRdb/db)缺失，影响下丘脑摄食中枢，导致食欲过盛，引起肥胖、高脂血症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗以及糖尿病，该模型同时也是研究DN肾脏早期形态学变化的良好模型，db/db小鼠在第4周即可表现出早期的肾脏病变，肾脏病理改变主要为系膜细胞增生、基质扩张以及基底膜增厚，随着病程进展db/db小鼠肾脏组织学呈进行性变化，8周开始出现蛋白尿，14-18周可出现肾小球细胞肥大、空泡变性、肾小管管腔变窄、肾间质小血管玻璃样变等病理改变，20周以后可出现中到重度蛋白尿，病理表现为肾小球节段性硬化[8]。

氧化应激是糖尿病肾病发生和发展的重要病理生理基础之一。高糖诱导肾小球系膜细胞产生过多的活性氧簇(ROS)，脂质过氧化作用增强，丙二醛(MDA)蓄积和过氧化物歧化酶(SOD)减少[9]，导致蛋白质非酶糖化、多元醇通路活化、DAG-PKC通路激活，导致与肾纤维化相关的TGF-β表达增加[10]，病理上可表现为肾小球和肾小管基底膜增厚，肾小球硬化和肾小管-间质纤维化等，临床上表现为尿蛋白增加。TGF-β1是最重要的促纤维化细胞因子，TGF-β1与肾小管上皮细胞上的TGF-β受体结合，可以激活包括Smad2，Smad3和Smad4在内的多种转录因子，刺激上皮细胞产生胶原、纤连蛋白、层粘蛋白等成分[11-12]，促导致肾脏组织纤维化。

本实验研究结果显示，从治疗第4周开始，番石榴叶提取物开始表现出显著的降低db/db小鼠体重和空腹血糖的作用，这个结果和我们课题组之前的研究结果是一致的。经过12周的治疗，番石榴叶提取物显著改善db/db小鼠肾脏肾小球扩张、球囊壁黏连、肾小球系膜细胞增生、肾小球毛细血管扩张、球旁器增生、肾小管扩张颗粒样变性等肾脏组织病理学改变。肾脏组织TGF-β1免疫组化蛋白定量测定结果提示，番石榴叶提取物具有显著降低了TGF-β1蛋白表达的作用。以上结果可以得出，对肾脏TGF-β1免疫组化蛋白表达的降调节，是番石榴叶提取物肾脏保护的作用机制之一。

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