麋鹿精子形态扫描电镜观察

2018-06-26白加德李俊芳李夷平张树苗

野生动物学报 2018年2期

陈颀白加德李俊芳李夷平张树苗

(北京麋鹿生态实验中心，北京，100076)

麋鹿(Elaphurus davidianus)是中国特有的濒危物种，是国家Ⅰ级重点保护野生动物，IUCN红色名录列为“野生灭绝”，20世纪初曾在中国本土灭绝。1985年在我国进行了重引入工作，现有麋鹿6000头左右，是世界上仅存18头麋鹿的后裔，面临着严重的近亲交配问题［1］。通过麋鹿精子形态结构的观察，有利于提高人工授精的成功率，利用麋鹿人工授精，建立麋鹿种质资源库，提高麋鹿血统改良的效率，遏制麋鹿遗传多样性的退化趋势。

精子超微结构研究是检验精液品质，揭示精子发生机制，开展受精生物学研究的一项重要内容［2］。精子的品质直接影响精子的穿卵能力和母体的受孕率［3－5］，麋鹿精子形态的扫描电镜观察尚未见报道，本实验使用扫描电镜对12头处于繁殖季节的麋鹿的精子进行形态观察，观察其表面的结构，阐明麋鹿精子的超微结构。对研究麋鹿授精机理、繁殖和种质资源的保存［6－7］，特别是利用人工授精技术保护濒危物种的应用具有重要意义［8］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 精子标本

2016年6～8月，在麋鹿发情期，选择发情旺盛雄鹿12头，利用DZCJ-3型电刺激采精仪，对麋鹿进行电刺激采精，取得新鲜精液，通过显微镜进行镜检，选用精子活动率大于50%的标本12例。

1.1.2 实验仪器耗材

DZCJ-3型电刺激采精仪，HCP-2临界点干燥器，SANYO烘箱，IB-5离子溅射仪，eppendorf离心机，Quanta 200扫描电镜，JEE-420真空喷镀仪，离心管，样品托，银导电胶，眼科镊子，青霉素小瓶，培养皿，载玻片，牙签，脱脂棉等。

1.1.3 实验试剂

0.25%～1%低浓度戊二醛、2.5%戊二醛(由戊二醛化学纯配制)、1%锇酸，丙酮(化学纯)、无水乙醇(化学纯)、醋酸异戊酯(化学纯)、双蒸水，0.1 mol/L pH 7.2磷酸缓冲液、液体二氧化碳、导电胶等。

1.2 方法

参照人精子扫描电镜样本制备方法［9－10］:于精液标本中加入浓度为0.25%的戊二醛，预固定15 min，使精子细胞保持形状，然后使用低浓度(0.25%～1%)戊二醛固定2 h以上，将精液经2000 r/min，离心10 min，弃去上清液，轻轻加入2.5%的戊二醛，用吹管轻轻吹打，使细胞分散;然后用0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗3次，每次5 min，50%、70%、90%乙醇梯度脱水，各1次，每次8 min;100%乙醇脱水3次，每次5 min，醋酸异戊脂置换3次，每次5 min;CO2临界点干燥;金属镀膜;扫描电镜(Quanta 200)观察。

2 结果

2.1 精液常规检查

由表1可知，对雄性麋鹿电刺激采精12头次，成功12次，电刺激采精成功率100%，采精量为0.5～2 mL，麋鹿每次射精量平均体积(1.07±0.58)mL，精子的平均密度(10.23±2.77)×108/mL，平均精子活力(0.76±0.09)，72 h鲜精活力(0.62±0.12)，精液品质良好，精液经稀释液稀释后72 h，鲜精活力达到0.6以上。

该技术可操作性强，实验室进行过多次电刺激采精，采精成功率都很高，采集的精液量充足而且质量很高。

表1 麋鹿电刺激采精结果Tab.1 The result of electro-ejaculation from Père David's deer

2.2 扫描电镜观察

2.2.1 正常精子形态

通过扫描电镜，可以观察到麋鹿完整的精子，其外形为细长圆柱状。在扫描电镜下观察，麋鹿精子和其他哺乳动物相同，属于典型的鞭毛精子，精子总长约41 μm。由头、颈、尾部构成，表面光滑。精子头部呈梨形，长约6.4 μm，宽约4 μm(图1)。大部分为精核，精核的电子密度较高，且为浓缩状。精核的前端较为膨大的部分为顶体，顶体约占头部的三分之二。连接头部和尾部的很短的区域为精子的颈部，细长的部分为精子的尾部，是精子代谢和运动的器官，可分为中段、主段和终段，在和颈部相连接处骤然变细。在扫描电镜下很难区别赤道带，可表现为顶体后沟增宽或位于头的最厚部分而不显凹陷。

2.2.2 畸形精子形态

正常形态精子的头部呈梨形，顶体区较光滑，颈部没有胞质残余，尾部可清楚地分为中段、主段和尾段［5，10］，本实验通过扫描电镜观察到了顶体破裂、颈部破裂、颈部膨大、主段膨大等形态改变的畸形精子，从图2～图5可以看出精子的头部(顶体)、颈部和尾部(主段)均发生了超微形态异常。

图1 正常麋鹿精子的形态(2000×)Fig.1 The normal morphology of Père David's deer's sperms(2000×)

图2 顶体破裂的精子(5000×)Fig.2 Sperms with rupture of the acrosome(5000×)

图3 颈部断裂的精子(5000×)Fig.3 Sperms with rupture of the neck(5000×)

图4 颈部膨大的精子(3000×)Fig.4 Sperms with enlargement of the neck(3000×)

图5 主段膨大的精子(5000×)Fig.5 Sperms with enlargement of the principal piece(5000×)

3 讨论

3.1 麋鹿电刺激采精结果

实验室曾对5只雄性麋鹿进行了6次电刺激采精试验，均取得了成功，采精技术成熟，电刺激采精成功率100%［8］。分别于6月［1］和9月对12头雄性麋鹿进行电刺激采精，多数采精量大于1.2 mL，精子活力大于0.6。通过表2可以看出麋鹿每次射精量平均体积、精子的平均密度、平均精子活力、72 h鲜精活力均没有显著变化。对9月采集精子进行扫描电镜观察，可以观察到正常精子形态和部分畸形精子形态。

表2 2次麋鹿电刺激采精结果对比Tab.2 The result of electro－ ejaculation from Père David's deer

3.2 麋鹿精子结构

与梅花鹿(Cervus nippon)［3］等哺乳动物精子结构相似，麋鹿精子具有膨大的顶体前端，其内储存着大量的顶体反应所需的多种酶类，以利于受精时精子穿透卵子。其颈段较长，可储存用于精子运动的大量能量。

3.3 精子样品的制备

一个合格的扫描电镜样品应该能观察到饱满的精子细胞、精子表面结构清晰而且无杂物，这就需要关注实验的漂洗、固定、脱水和干燥等环节。合适的实验条件下，可以观察到正常麋鹿精子头部呈梨形。实验过程中发现，不同的实验条件下，会观察到不同形态的畸形改变，电镜下精子头部明显皱缩，呈扁片状，可能原因有:(1)制样过程中脱水时间过长。由于水的表面具有张力，脱水时间长会使样品受到脱水张力的损伤，发生收缩和变形［11］。(2)临界点干燥不彻底。过渡液醋酸异戊酯与CO2混合后被排尽，去除临界状态下细胞表面张力，从而形成饱满的形态［9］，这步临界点干燥是决定样品质量的关键一步，如果干燥不彻底就会导致细胞黏合成团［12］，不能显示完成的形态。因此在制备精子样品时，需要注意实验操作。

3.4 精子畸形的部位及原因分析

正常精子标本中可能都有些老、弱、病、残的精子，实验中进行电镜观察时发现精子头部、颈部开裂较多见，而尾部中间断裂较少。推测是因为:(1)精子是特化细胞，它的头部和颈部是储存能量的部位，结构较脆弱，制备过程中耐受性比较差，容易破裂或者断裂，造成畸形。(2)精子头部、颈部和尾部的结构和含水量各不相同［13］。而精子尾部含水量相对较多，因此不容易发生断裂或开裂现象。