广西地区荔浦芋新品种疫霉交配型和甲霜灵抗性研究

董伟清 江文 何芳练 高美萍 韦绍龙 蒋慧萍 闭志强 颜梅新

芋[Colocasia esculenta （L.） Schott]属天南星科芋属，为多年生宿根草本植物，原产于中国。芋具有很高的营养价值，其球茎富含淀粉、维生素和氨基酸等营养成分，是世界各地广为栽培的蔬菜和粮食作物，也是可选的生物能源作物，许多品种还具有药用价值[1]。目前广西已成为全国芋头的主要产区之一，其中以荔浦地区种植的荔浦芋尤为出名，拥有超340 a的栽培历史，已成为我国地理标志产品。广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所选育的荔浦芋新品种桂芋2号，以其产量高、品质优、淀粉含量高、适应性广等特点已成为广西槟榔芋的主栽品种；但在栽培过程中常遭受芋疫病的为害，其品质和产量受到严重影响，给广西芋头产业造成严重的经济损失。因此，开展桂芋2号芋疫病病原的研究，对桂芋2号生产和芋疫病防治具有重要意义。目前尚未见关于桂芋2号在不同生态栽培区芋疫霉的研究报道，本文以荔浦芋新品种桂芋2号在不同生态栽培区芋疫病标样为研究对象，采用形态观察和分子生物学手段鉴定其疫霉种类，通过与辣椒疫霉配合明确其交配型类型，并测定病原对甲霜灵的敏感性，为芋疫病的综合防治及抗病育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 芋疫病样本采集与病原菌分离

芋疫病样本于2016年7～10月分别采集于南宁市、柳州市柳江区、桂林市荔浦县青山镇、贺州市贺街桂芋2号栽培区。病原菌分离采用常规组织分离法[2]。将具有芋疫病典型症状的病叶，从病健交接部位切取3 mm×4 mm大小的组织块，经表面消毒（75%酒精10 s，0.1%升汞1 min，无菌水冲洗2～3次）后移入 10%V8 培养基上[3]，25℃培养 4～5 d，待平板长出菌丝后，挑取菌落边缘单菌丝的尖端移入不加抗生素的10%V8培养基上进行纯化。将纯化后的菌株放入20℃的冰箱中保存备用。

1.2 病原菌的致病性测定

致病力测定参照周清平等[4]的方法，选取无病芋嫩叶置于室内搪瓷盘中，搪瓷盘事先放2层纱布，加适量的灭菌水保湿，在叶片选4个点，其中3个点分别滴加20 μL的106个/mL孢子的孢子悬浮液，另一个点滴加20 μL灭菌水作对照。点样后套上塑料薄膜盖住搪瓷盘保湿，于28℃恒温培养箱中培养，4 d后观察发病情况。对接种发病的芋叶组织进行病原菌再分离，观察分离物是否与接种菌一致。

1.3 病原菌形态鉴定

病原菌形态鉴定参考李智军等[5]方法，略有修改。将分离纯化得到的菌株在10%V8培养基上28℃培养3 d后，切取菌落边缘的菌丝块移至10%V8培养基中央，放置生化培养箱中28℃培养3～5 d，观察菌落形态，经光学显微镜观察病原菌形态特征并拍照。

1.4 芋疫霉菌菌株ITS序列分析

芋疫病菌总DNA提取采用SDS裂解法。采用真菌核糖体转录间隔区通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 和 ITS5 （5'-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG-3'）进行 PCR 扩增。PCR反应条件为：94℃预变性2 min，进入循环，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶成像系统观察和照相，PCR产物送上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果用 Blast（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行DNA序列分析。

1.5 芋疫霉的交配型鉴定

将分离获得的芋疫霉菌株及辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株、A2交配型S-5菌株（由中国农业大学植物病理学系刘西莉教授课题组惠赠）接种至10%V8培养基上，置于28℃恒温箱中培养5 d。用消毒牙签挑取大小约4 mm×4 mm的各待测菌株菌块接种至10%V8培养基平板上，各待测菌株分别与辣椒疫霉A1或A2交配型菌株进行对峙培养[3,6]，两菌丝块相距30～40 mm，每处理设3皿重复，分别设芋疫霉菌株单株自身配对，辣椒疫霉A1和A2交配型菌株对峙培养及A1、A2菌株单株自身配对为对照。置于28℃下黑暗培养7 d，通过光学显微镜观察是否产生卵孢子并拍照，从而鉴定芋疫霉菌株交配型类型。

1.6 芋疫霉对甲霜灵的敏感性测定

芋疫霉对甲霜灵的敏感性测定参考Goodwin等[7]的方法，略有修改。在10%V8培养基上培养5 d的疫霉菌株菌落边缘切取直径约5 mm的菌块，分别接种至含甲霜灵0、5、100 mg/L的培养基平板中央，置28℃培养7 d，测量其菌落大小，每处理设3个重复。抗性测定标准参考Misra等[8]，甲霜灵浓度为5、100 mg/L的平板上菌落生长量均≥40%对照（甲霜灵浓度0 mg/L）生长量为抗性；两者均≤40%对照生长量为敏感；甲霜灵浓度为5 mg/L平板上菌落生长量≥40%对照生长量≥甲霜灵浓度为100 mg/L平板上菌落生长量，为中度抗性。

2 结果与分析

2.1 病害症状

芋疫病主要为害叶片，也侵染叶柄。芋叶片上初生病斑为黄褐色圆形斑点，后逐渐扩大融合形成圆形或不规则形的大斑，病斑具有明显的褐色同心轮纹，边缘具水渍状暗绿色或黄色晕圈。潮湿时病斑表面生灰白色霉层，并具有黄色至淡褐色胶质分泌物（图 1）。

2.2 芋疫病病原菌的形态特征

从表现明显症状的芋叶组织分离纯化获得8个菌株，在10%V8培养基上培养5 d后，8个菌株菌落基本一致。菌落圆形，边缘整齐，整体呈浅黄至黄白色，气生菌丝较少，无隔，无色透明，宽 3.80～6.84 μm。孢子囊卵形、长卵形、椭圆形，基部圆形，顶部有一乳头状突起（图 2A、2B、2C）。 游动孢子（图 2D）在孢子囊内产生，圆球形，通过排孢孔挤出，并迅速游动，每个孢子囊可以产生数个游动孢子。根据病原菌的培养性状和形态特征，参照郑小波[6]、陆家云[9]对疫霉的描述，初步将该病原菌鉴定为芋疫霉Phytophthora colocasiae。经致病性试验，8个芋疫霉菌株致病力相当，所引起的症状与原症状相似，从接种组织中分离获得的病原菌与原接种菌形态一致。

2.3 芋疫病菌分子生物学鉴定

以待测的8个芋疫霉菌株的总DNA为模板，采用ITS4和ITS5引物进行PCR扩增，结果发现所有测试菌株均获得大小约为890 bp的产物。测序结果表明，所测序列与GenBank发表的Phytophthoracolocasiae不同分离物序列同源性达99%，进一步确定所测菌株均为芋疫霉（P.colocasiae）。

图1 芋疫病症状

2.4 芋疫霉交配型的鉴定

芋疫霉待测菌株分别与辣椒疫霉A1、A2交配型菌株对峙培养7 d后（图 2E），利用消毒牙签挑取两菌交界处的菌丝放在玻片上置于显微镜下观察卵孢子。结果发现所有待测的8个芋疫霉菌株和辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株的对峙培养均可观察到卵孢子的产生（图2F），说明待测的8个芋疫霉菌株均属于A2交配型，对照辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株和A2交配型S-5菌株对峙培养可观察到卵孢子（图2G），而待测8个芋疫霉菌株与A2交配型S-5菌株对峙培养，8个芋疫霉菌株、辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株及A2交配型S-5菌株单独培养均未发现卵孢子，说明8个芋疫霉菌株不属于A1交配型或其他交配型。

2.5 芋疫霉对甲霜灵的敏感性

8个芋疫霉菌株在甲霜灵0 mg/L浓度处理下，28℃培养7 d后菌落长满整个培养皿，而在甲霜灵5 mg/L和100 mg/L浓度处理下，8个芋疫霉菌株菌落直径大小均为0 mm。

图2 芋疫霉形态特征

3 讨论

传统的疫霉鉴定主要根据菌落、有性器官、孢子囊、孢囊梗等形态特征进行[10]。由于疫霉菌形态特征会因培养条件不同而存在差异，加之自身形态具有较大的变异性，给疫霉的分类鉴定带来一定难度。随着分子生物学鉴定手段运用于疫霉的分类鉴定中，许多报道已经证实疫霉菌5.8S rDNA ITS区域是一段稳定、保守而又具有种间特异性的基因区域，可以通过该区域设计特异性引物对疫霉进行分子鉴定[10～12]。陆叶等[3]对来源于我国广西桂东南地区的疫病霉株ITS序列进行分析，所测序列与GenBank发表的P.colocasiae不同分离物序列同源性高达97%～100%。而本研究结合形态特征和分子生物学手段对不同生态栽培区的桂芋2号芋疫霉菌菌株进行了鉴定，所测ITS序列与NBCI上公布的芋疫霉菌分离物同源性达99%。

芋疫病病原早于1890年在印度尼西亚被鉴定为Phytophthora colocasiae[13]，该菌属于疫霉属（Phytophthora），有性生殖营卵配生殖，属异宗配合，一般需要两种不同交配型菌株进行有性生殖产生卵孢子，而卵孢子是疫霉菌度过不良环境及越冬的主要菌态[3]。Ko[14]对来自夏威夷101个芋疫霉菌株进行分析，发现这些芋疫霉菌株均为A1交配型，而另外来自亚洲的5个芋疫霉菌株则鉴定为A2交配型。Ann等[15]对采集自中国台湾的799个芋疫霉分离物进行交配型鉴定，发现所有测试菌株均为A2交配型，作者认为台湾不是芋疫霉菌的起源地。而Lin等[16]对台湾芋疫霉菌研究发现绝大部分菌株属于A2交配型，另外，在某些地方还发现了A1A2交配型菌株，并通过无性培养获得了A1交配型菌株，作者认为台湾芋疫霉在某些地方存在遗传多样性的可能。Zhang等[17]对我国海南芋疫霉菌进行研究，结果表明海南芋疫霉存在着丰富遗传多样性，280个芋疫霉菌株中A1交配型菌株有136个,102个菌株为A2，而42个菌株为A0交配型，据此作者认为我国海南为世界芋疫霉的起源中心。据报道，印度北部芋疫霉也存在丰富的多样性，到目前为止发现 A1交配型和 A2交配型同时存在[8，18，19]。陆叶等[3]对广西桂东南地区的芋疫霉菌株进行交配型测定，结果发现所有芋疫霉菌株均属于A2交配型。本研究分离获得的8个芋疫霉菌株交配型均为A2交配型，与陆叶等研究结果相似。因此推断，这些地区桂芋2号芋头产区田间芋疫霉发生有性生殖的可能性非常低。

化学防治是防治疫病的重要措施之一，而甲霜灵是防治疫病比较有效的药剂之一，但在20世纪90年代开始陆续报道一些疫霉对该药剂产生了抗药性，如Phytophthora parasitica[20]，Phytophthora infestans[21]。对于芋疫霉抗药性，Misra等[8]报道在印度分离到一株芋疫霉98-111对甲霜灵产生了抗药性，说明芋疫霉已经开始对甲霜灵产生了抗药性。而本研究的芋疫霉菌对甲霜灵非常敏感，在5 mg/L浓度下生长受到抑制。

4 结论

芋疫病主要以带菌球茎为初侵染源，发病部位上产生的孢子囊和游动孢子通过气流和雨水击溅传播，成为病害发生与流行的主要因素。对于4个桂芋2号栽培区的疫病采用因地制宜的防治措施，建议与玉米、水稻、姜等作物轮作、间作，同时注意避免与茄科、葫芦科、豆科等辣椒疫霉的寄主轮作、间种。种植脱毒健康种苗，减少病害的发生。此外，甲霜灵仍可作为化学防治的主要药剂，建议与其他药剂交替使用。

[1]赵国华，陈宗道，王赟.芋头多糖的理化性质及体内免疫调节活性研究[J].中国食品学报，2002，2（3）：21-25.

[2]方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，1998.

[3]陆叶，陆志翔，何芳练，等.桂东南地区芋疫霉的交配型研究[J].基因组学与应用生物学，2013（3）：285-290.

[4]周清平，胡汉桥，梁钾贤，等.芋疫病抗病性鉴定及药剂筛选[J].湖北植保，2012（5）：27-30.

[5]李智军，龙卫平，郑锦荣，等.广东辣椒疫霉菌分离鉴定及其致病力和生理小种分化研究 [J].华南农业大学学报，2007，28（1）：50-54.

[6]郑小波.疫霉菌及其研究技术[M].北京：中国农业出版社，1997.

[7]Goodwin S B,Sujkowski L S,Fry W E.Widespread distribution and probable origin of resistance to metalaxyl in clonal genotypes ofPhytophthora infestansin the United States and Western Canada[J].Phytopathology,1996,86(7):793-800.

[8]Misra R S,Mishra A K,Sharma K,et al.Characterisation of Phytophthora colocasiaeisolates associated with leaf blight of taro in India[J].Archives of Phytopathology&Plant Protection,2011,44(6):581-591.

[9]陆家云.植物病原真菌学[M].北京：中国农业出版社，2001.[10]程亮，温国泉，吴永官，等.广西南瓜疫病的病原分离与鉴定[J].西南农业学报，2014，27（6）：2 398-2 401.

[11]王源超，张正光，郑小波．核糖体基因ITS作为芝麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究[J].菌物系统，2000，19（4）：485-491．

[12]李卫民，晏卫红，黄思良，等．广西黑皮冬瓜疫病的病原菌鉴定及其生物学特性[J].植物病理学报，2007，37（3）：333-336．

[13]Misra R S,Sharma K,Mishra A K.Phytophthora leaf blight of taro (Colocasia esculenta)-A review[J].The Asian and Australasian Journal of Plant Science and Biotechnology,2008,2:55-63.

[14]Ko W H.Mating-type distribution ofPhytophthora colocasiaeon the Islands of Hawaii[J].Mycologia,1979,71(2):434-437.

[15]Ann P J,Kao C W,Ko W H.Mating type distribution of Phytophthora colocasiaein Taiwan [J].Mycopathologia,1986,93(3):193-194.

[16]Lin M J,Ko W H.Occurrence of isolates ofPhytophthora colocasiaein Taiwan with homothallic behavior and its significance[J].Mycologia,2008,100(5):727.

[17]Zhang K M,Zhang F C,Li Y D,et al.Isolates of Phytophthora colocasiaefrom Hainan Island in China evidence suggesting an Asian origin of the species[J].Mycologia,1994,86(1):108-112.

[18]Narula K L,Mehrotra R S.Occurrence of A1 mating type ofPhytophthora colocasiae [J].Indian Phytopathology,1980,33(4):603-604.

[19]Tyson J L,Fullerton R A.Mating types ofPhytophthora colocasiaestrains from the Pacific region,India and Southeast Asia[J].Australasian Plant Disease Notes,2007,2:111-112.

[20]Deahl K L,Inglis D A,DeMuth S P.Testing for resistance to metalaxylin Phytophthora infestansisolatesfrom Northwestern Washington [J].American Potato Journal,1993,70:779-795.

[21]毕朝位，车兴壁，马金成，等.致病疫霉对甲霜灵抗性及抗性水平测定[J].西南大学学报：自然科学版，2002，24（4）：307-309.