云南省师宗县牛羊蓝舌病病毒感染情况及活动规律监测

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蓝舌病(Bluetongue,BT)是一种由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒((Bluetongue Virus, BTV)引起的，通过昆虫库蠓(Culicoides)传播的非接触性反刍动物传染病[1-2]，动物感染BTV的平均死亡率为30%，绵羊高达80%[3]。OIE将其列为须通报疾病，我国归为一类动物疫病。BT流行广泛，目前尚无有效的治疗方法[4]，当BTV的不同血清型毒株在同一区域同时流行时，容易发生基因重组，全球共有27种不同的BTV血清型，在中国已有BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-12、-15、-16、-21、-24等11种血清型被分离报道[5]，不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护给BTV的防控带来了严峻挑战[6-7]。

云南省师宗县地处滇中地区，有亚热带与温带共存的气候特征，冬春季受大陆季风的影响，晴天偏多，光照充足，气候温和干燥，夏秋季受海洋季风的影响，阴雨偏多，光照差，气候温凉潮湿。总的情况是终年温和，雨热同期，干湿分明，非常适宜蚊虫生长[8-10]。云南BTV的传播与媒介昆虫、地理环境、气候变化都紧密相关[11]，1979年张念祖等在云南省师宗县首次分离到蓝舌病病毒，从而确定本病在我国的存在[12]。1995年由12头BTV抗体阴性黄牛组成的监控群在师宗县建立，随后监控动物转阳，成功分离到蓝舌病病毒。2012年肖雷等[13]在师宗县分离获得67株蓝舌病病毒，可见云南省师宗县是蓝舌病高发地区。为了解近年来云南师宗县蓝舌病病毒活动情况，参照澳大利亚病毒监测模式[14]，自2014年起，连续3年在云南省师宗县五龙乡建立监控群，每年设立监控动物15只，从5-10月，每周采血一次，11月、12月，每月采血1次，每份血清样品经BTV C-ELISA检测，连续的血清学检测数据可得出师宗县近3年来蓝舌病病毒的感染情况以及病毒活动的时间规律，每份血液样品盲传分离病毒，根据3年分离获得的蓝舌病毒株数量及病毒的血清型，可推测出当地流行的蓝舌病主要血清型，对蓝舌病的预警、风险评估、流行病的研究起到重要作用。

1 材料与方法

1.1 监控群建立

1.1.1监控动物的选择 因蓝舌病病毒可引起绵羊发病和死亡，而牛和山羊多为隐性感染，所以2014-2016年每年4月筛选年龄小于1岁且蓝舌病抗体检测为阴性的10头健康黄牛和5只健康山羊为监控动物设立监控动物群，3年累计设立监控群3个，监控动物45头。

1.1.2监控动物的管理 筛选出来的监控动物用耳标进行专门标识，与其它牛羊混群放牧，禁止使用杀虫药。

1.1.3采血 每年的5月到10月，每周采血1次，11月、12月，每月采血1次，每头监控动物每次采集常规全血、肝素抗凝血各1管(10 mL)，常规全血分离获得血清，-20 ℃保存，用于血清学检测，肝素抗凝血，4 ℃保存，用于病毒分离。

1.2 血清学监测

1.2.1实验材料 BTV C-ELISA检测试剂盒由云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室提供，并仅限实验室使用[15]。

1.2.2检测方法 按检测样品数量取出2 ℃～4 ℃保存的ELISA板，置室温15 min，并编号；根据编号每孔加入50 μL 10%稀释的待检血清和阴性、阳性、弱阳性对照血清各2孔，空白对照加4空；同时按每孔50 μL加入竞争抗体，此时每孔共100 μL液体，空白对照用稀释液补充至100 μL，震荡混匀后置37 ℃温箱里温育60 min；取出温育好的板，用PBST洗液洗板2次，在吸水纸上轻轻拍干；每孔加入50 μL酶标二抗工作液震荡混匀后置37 ℃温箱里温育30 min；用PBST洗液洗板5次，吸水纸上轻轻拍干；每孔加50 μL底物反应液，37 ℃避光温育10 min，每孔再加终止液50 μL终止反应，37 ℃避光显色15 min ，读取OD450nm值。

1.2.3结果判定 检测合格条件：两个阳性对照孔OD450≤0.2，两孔间OD450差距小于0.05，两个阴性对照空孔OD450≥1.0且<1.6，两孔间OD450差距小于0.2。

按照抑制率(PI)=(阴性对照OD450平均值-样品血清OD450)/阴性对照OD450平均值×100%，抑制率≥50%时判为抗体阳性，否则为阴性。

1.3 病毒分离

1.3.1样品准备 在1.5 mL微量离心管中加入1 mL PBS、200 μL肝素抗凝血红血球，颠倒混匀5次；1 000 r/min离心10 min，轻轻吸弃上清；加入800 μL灭菌双蒸水，涡旋混匀，确保红细胞充分裂解，准备好的样品作为接种液备用。

1.3.2接种细胞 将长成单层的BHK-21细胞瓶，根据血液样品编号对细胞瓶进行编号，每个样品标记2瓶；弃去细胞瓶中的培养液，取500 μL接种液接种到相对应的细胞瓶内，每个样品接种2瓶，置37 ℃培养箱感作1 h后加入10mLMEM维持液，再置37 ℃培养箱中培养7 d，每天观察细胞病变情况，与对照细胞相比，病变程度以+、++、+++表示，有25%细胞出现CPE时记做+，50%细胞出现CPE时记做++，75%细胞出现CPE时记做+++；连续在BHK-21细胞上传3代，出现CPE的细胞瓶4 ℃保存，扩大培养，存于-80 ℃冰箱，待鉴定；3代都无CPE的细胞瓶视为病毒分离阴性，可弃之。

1.4 阳性分离物鉴定

1.4.1提取阳性分离物的RNA 取接毒后CPE达到70%的单层培养BHK-21细胞，按TRizol试剂盒方法抽提总RNA。

1.4.2引物的设计与合成 根据基因库提供的BTV各基因序列，通过分析软件，对BTV较为保守的RNA7(VP7基因)片段设计引物[9]：

BTV-S7-A：5′-GTTACAATGCGCCCGACATC-3′

BTV-S7-B：5′-TGTAATGCGGCCTGTCCAT-3′

扩增产物长度为555 bp。引物由大连天宝生物工程公司合成，用RNase-free ddH2O稀释成20 pmol/μL备用。

1.4.3病毒双链RNA变性 在PCR反应管中加入所提取的核酸样品10 μL，甲酰胺5 μL，95 ℃ 5 min，速取出置冰上。

1.4.4cDNA的制备 在PCR反应管中加入变性好的模板RNA 8 μL，下游引物1 μL，dNTP Mixture 1 μL，65 ℃保温10 min，冰浴2 min，置于冰上；加入10 μL提前配好混匀的反应5×PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，PrimeScript Reverse Transcriptase(200 U/μL)1 μL，RNase free dH2O 4.5 μL，此时PCR反应管里共有液体20 μL，混匀后，42 ℃ 60 min，70 ℃保温15 min后冰上冷却，得到的cDNA溶液，-20 ℃保存备用。

1.4.5病毒的RT-PCR鉴定 以cDNA为模板，在50 μL PCR体系中完成反应，反应参数为95 ℃ 52 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个偱环；72 ℃ 5 min，4℃ 保持。取PCR扩增产物5 μL与1 μL 6×DNA上样Buffer混匀，点样于12 g/L琼脂糖凝胶上样孔中，80 V电泳30 min，置于凝胶成像系统中紫外光照射，观察记录结果。

1.4.6病毒血清型的鉴定 Karber方法计算TCID50，应用南非参考毒株标准血清按《澳大利亚动物疫病诊断技术标准》进行中和试验[16]。

2 结 果

自2014年建立监控群以来，共计采血80次，收集监控动物血清1 200份，所有血清均在采血后1周之内进行BTV C-ELISA检测，监控动物抗体转阳后，抗体阳性持续5周以上，监测数据连续可靠。统计监控动物血清蓝舌病抗体检测结果，3年均有动物感染，2014年感染率60%，2015年感染率为33.33%，2016年感染率为13.33%；黄牛感染率略高于山羊感染率(表1)。

表1 2014-2016年监控动物蓝舌病感染情况统计

Tab.1 Natural infection rate of bluetongue disease in sentinel animals from 2014 to 2016

时间采血次数动物种类动物数量感染动物数量感染率2014年28次黄牛10770%山羊5240%2015年25次黄牛10220%山羊5360%2016年27次黄牛10220%山羊500%

统计3年的监控动物蓝舌病抗体检测结果，监控动物感染BTV的时间均在6-10月之间，其中以7月和10月感染动物最多，且7月连续3年都有动物感染(图1)。

图1 2014-2016年监控动物感染BTV的数量和感染时间统计图Fig.1 Number of sentinel animals infected with BTV and the time of infection during 2014-2016

16个感染BTV的监控动物中有7个分离到病毒，共9株，BTV对BHK-21细胞上的病变产生明显的细胞病变，细胞病变产生比较迅速，接种BHK-21细胞24 h就可以观察到明显细胞病变，48 h CPE可达到70%以上，细胞病变特点为变圆、肿胀、脱落(图2)。

A:正常BHK-21细胞；B:感染BTV 48 h后的BHK-21细胞图2 BTV对BHK-21细胞的致病变作用Fig.2 CPE of BHK-21 cells infected with BTV

2014年在3头感染黄牛红细胞内分离获得4株BTV共3个血清型，分别为BTV-2、4、12型，感染山羊红细胞内未能获得分离毒株；2015年在1头感染黄牛红细胞内分离获得1株BTV，鉴定为BTV-9型，在3只感染山羊红细胞内分离获得4株BTV，均为BTV-16型；2016年未能获得分离毒株(表2)。

表2 2014年-2016年BTV分离鉴定情况统计

Tab.2 Isolation and identification of the BTV details during 2014-2016

时间分离毒株数量病毒编号血液样品编号血清型鉴定动物耳号采血时间2014年4株V07310933BTV-4黄牛5号2014.9.2V11310939BTV-2/12黄牛21号2014.9.2SZ111428BTV-4黄牛2号2014.9.232015年5株SZ214903BTV-9黄牛20号2015.6.30V15014933BTV-16山羊2号2015.7.7V14915259BTV-162015.7.21SZ316860BTV-16山羊3号2015.10.13SZ416979BTV-16山羊4号2015.10.202016年0株/////

2012年在师宗县分离的蓝舌病病毒包含7个血清型，分别为BTV-1、BTV-3、BTV-5、BTV-9、BTV-12、BTV-16、BTV-24型，2014年新增了2个血清型BTV-2、BTV-4型。(图3)

图3 近年来师宗县分离蓝舌病毒株的血清型统计图Fig.3 Serotype of the BTV was isolated in Shizong County

3 讨 论

2008-2009年云南省境内地区牛、羊蓝舌病的感染率为23.0%，其中师宗县370份羊血清中，BTV抗体阳性率为0%[17]。本次监测实验由于监控动物是在自然界放牧饲养管理，干扰试验结果因素较多，且监控动物数量有限，因此在检测结果中出现了2016年山羊感染率为0%的情况，但2016年的黄牛感染率为20%，证明2016年仍有蓝舌病病毒活动，且3年平均牛、羊感染率为35.56%，远高于2008-2009年的调查结果，说明蓝舌病病毒在师宗县长期存在并有活跃的趋势。

蓝舌病是由库蠓传播的一种虫媒病毒病，因此蓝舌病的活动规律主要取决于库蠓的活动情况，1991年李华春等在调查蓝舌病传播媒介库蠓时，曾报道云南省师宗县多在7-10月发生蓝舌病[18]，与本次监测结果一致。库蠓在6月上旬开始活动，7-9月是活动高峰期，这样的季节性消长规律使蓝舌病的流行也具有明显的周期性和季节性，也提示了蓝舌病的防控关键时期是每年的6-10月，且杀虫灭蚊尤其重要。

2014-2016年，有16个监控动物感染BTV，从其中7个感染动物的红细胞内分离到9株BTV，包含5个血清型，病毒分离效率较高，证明本研究的病毒分离方法成熟。2014年21号黄牛红细胞内同时分到2株病毒，且为不同的血清型，该黄牛可能被同时携带两个血清型的媒介昆虫叮咬，也可能是两个携带不同血清型的媒介昆虫在1周之内都叮咬了该黄牛[19]。2015年2号山羊红细胞内分离到BTV-16型毒株，时隔两周又分离到同一毒株，证明BTV在动物红细胞中至少存活14 d。

2012年，在师宗县分离到的BTV毒株已包含7个血清型，2014年增加至9个，其中BTV-5、-9、-24为我国首次发现[20]，可能还有未被发现的血清型，说明师宗县存在多种血清型的BTV流行，且以BTV-3、BTV-5、BTV-16为优势血清型。多种血清型同时存在，型与型之间无交叉保护，这给蓝舌病的防治带来了严峻考验，不仅需要继续对BTV感染情况及活动规律进行研究，还急需开展蓝舌病血清型灭活疫苗、新型疫苗研究，开发多价蓝舌病通用疫苗，建立疫苗生产技术储备[21]。

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