UPLC-MS/MS方法在葡萄酒花色苷鉴定过程中对两种锦葵色素同分异构体的分离

王昶森，杨志伟，刘亚新，张 昂，金 刚，王 飞，张进杰

（1.秦皇岛出入境检验检疫局技术中心，河北秦皇岛066004；2.宁夏大学葡萄酒学院，宁夏银川750021）

多酚化合物是存在于葡萄果皮上的一类重要的次生代谢产物。这类物质随着葡萄果实的破碎、压榨和发酵等处理进入葡萄酒中，进而对葡萄酒的品质特征产生影响。作为功能性物质，花色苷不仅影响葡萄酒的色泽，而且可通过与其他物质的结合，影响葡萄酒质量的稳定性[1]。

花色苷常以糖苷形式存在，是由花色素与葡萄糖相结合而生成的糖苷类化合物[2]。花色苷的结构可以分为四大类：基本花色苷、酰化花色苷、吡喃花色苷、聚合花色苷[3-6]。基本花色苷主要有5种形式：飞燕草花色素苷、锦葵花色素苷、芍药花色素苷、矢车菊花色素苷和矮牵牛花色素苷。花色苷作为葡萄酒主要呈色物质，使其呈现出不同颜色，对葡萄酒的感官品质起到决定性作用。葡萄中，花色苷主要存在于红色、紫色葡萄浆果皮中最靠近表皮3～4层细胞的液泡中[7]。葡萄酒中花色苷的组成特征蕴含了产地、品种、年份以及酿酒工艺等信息，此外，栽培方式、生态条件、陈酿时间等因素都能不同程度地影响花色苷[8-9]。葡萄酒中花色苷物质的组成和含量主要取决于葡萄品种，可作为区分不同品种红葡萄酒的化学标志。

除此之外，花色苷还有抗氧化的作用，且针对老年病有着特殊的功效，在预防老年痴呆，抗糖尿病，保护血管、动脉，抗高血压，抗炎，抗突变肿瘤、癌症等方面效果显著。

因此，分析葡萄及葡萄酒中花色苷尤显重要。但是在探索过程中发现锦葵色素产生了两种同分异构体，即锦葵色素3-O半乳糖苷和锦葵色素3-β葡萄糖苷，这两种物质极性相似、性质相似，用其他花色苷的区分方法无法分离。所以建立了新的方法探讨这两种花色苷同分异构体的分离。

两种花色苷同分异构体的信息见图1和图2。

图1 锦葵色素3-O半乳糖苷

图2 锦葵色素3-β葡萄糖苷

本实验使用的AB Sciex QTRAP®5500 LC/MS/MS系统相比较于其他液质仪器其主要特点有：(1)创新的QJet-2离子导入技术：极大地提高了系统的灵敏度，改善了真空的分配；(2)创新的弯曲LINAC碰撞室：提高了离子传输速度，增加了离子容量，同时有效地防止交叉污染，改善了质谱数据质量；(3)创新的Q3线性加速技术：极大地提高了MS/MS扫描能力；(4)独特的“杆-阱扫描”(MRMIDA-EPI)方式：可以建立高质量的EPI质谱库；(5)创新的AcQuRate脉冲离子计数检测器：确保系统的重现性和精确性；(6)创新的eQ电子学设计：确保进行快速扫描和快速正负切换扫描；(7)专利的气帘气接口技术：降低了污染，提高工作效率；(8)Turbo V离子源：这是常规应用的高性能离子源，可适应范围的液相流速要求，有效防止电喷雾的离子抑制现象，具有自清洁探头的功能；(9)最新版Analyst 1.5软件提供了最新的定量分析工具包，而且具有智能化的s-MRM数据采集模式。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

葡萄酒：长城四星干红葡萄酒(Great Wall Four-Star Red,Shacheng,China)。

试剂及耗材：三氟乙酸、甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯，Fisher(Fairlawn，NJ，USA)公司；锦葵色素3-O半乳糖苷和锦葵色素3-β葡萄糖苷，标准品纯度大于 99.5%，Extrasynthese SA(Genay，France)公司。

仪器：AB Sciex QTRAP® 5500 LC/MS/MS系统，美国AB公司；去离子水机。

1.2 试验方法

1.2.1 标准品的稀释

将标准品拆封后根据说明书的浓度显示使用含5%甲酸的甲醇溶液稀释至1 ppm装瓶、充氮、密封、冷藏待用。

1.2.2 优化质谱条件

将配制好的标准品稀释至1 ppb用移液枪移至进样瓶，进入质谱仪优化Q1、Q3、DP、CE、CXP等参数，质谱参数见表1。

1.2.3 样品的制备

表1 质谱参数

取部分酒样，用含5%乙腈的0.1%三氟乙酸稀释500倍，涡旋混合后用移液枪转移1 mL至进样瓶。

1.2.4 进样准备

第一次进样：分别将两种标准品稀释至1 ppb，分别进样，随后两种标准品混合至1 mL进样。

第二次进样：将两种标准品等量与酒样混合至1 mL进样。

1.2.5 色谱条件

ODS色谱柱(C18柱)，美国安捷伦公司(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B：乙腈。洗脱程序：0～0.5 min，0%～5%B；0.5～0.6 min，5%～15%B；0.6～2.5 min，15%B；2.5～2.6 min，15%～18%B；2.6～5 min，18%B；5～5.5 min，18%～5%B；5.5～8 min，5%～0%B。

柱温：30℃；检测波长：525 nm；波长扫描范围：200～900 nm；进样量：30 μL。质谱采用电雾喷离子源(ESI)，正离子模式，离子扫描范围：100～1000 m/z；喷化器压力：35 psi；干燥气流速：10 L/min；干燥气温度：350℃。每个样品重复进样2次。梯度洗脱程序见图3。

图3 梯度洗脱

2 结果与分析

图4 锦葵色素3-O半乳糖苷和锦葵色素3-β葡萄糖苷出峰图

锦葵色素3-O半乳糖苷和锦葵色素3-β葡萄糖苷出峰图见图4。由图4可看出，使用这种方法和梯度洗脱可以将两种同分异构体分离，与第一次进样的图对比可知，混标中1号峰为锦葵色素3-O半乳糖苷，2号峰为锦葵色素3-β葡萄糖苷，所以第二次进样即可分辨两种花色苷，此方法可应用于鉴别葡萄酒中是否含这两种花色苷，并区分。

在建立方法后，使用该方法对一批酒样进行了检测，验证了方法的普遍性。结果见表2。

经检验可知，葡萄酒中的锦葵色素3-O半乳糖苷含量较高且在整体花色苷中所占比例也较大，而作为其同分异构体的锦葵色素3-β葡萄糖苷含量较少。所以两种物质可以主要考虑锦葵色素3-O半乳糖苷。

3 结论

本方法的优势在于：

(1)利用UPLC-MS/MS的方法对葡萄酒两种花色苷进行了分离,试验方法有很好的重复性,分离效果好,两种花色苷的峰图有较好的峰型以及分离度。该方法可以作为两种同分异构体的区分方法。

(2)对两种葡萄酒花色苷进行了分析,并建立了参考模型。参考模型从图形和数据上反映出不同花色苷的差别,两种花色苷可以通过特征峰的响应值和保留时间区别。

(3)与前人的研究方法对花色苷的研究方法比较,本研究使用了更为先进的UPLC-MS/MS方法,完整地比较出峰的特征,不需要对葡萄酒中的物质进行鉴定和定量测定,大大简化了分析操作。

(4)初步建立两种葡萄酒花色苷UPLC出峰图谱数据库,对同分异构体花色苷进行了很好的区分。继续对此数据库的完善,可以更有效地鉴别更多性质相似的花色苷。

表2 锦葵色素3-O半乳糖苷及锦葵色素3-β葡萄糖苷含量

但是该方法只能测定酒样里有无花色苷及其含量，无法鉴定花色苷在酒中起的影响和性质，所以该实验方法尚需改进。

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