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伴骨髓浸润的成熟自然杀伤细胞肿瘤15例临床和实验室特征及预后分析*

2018-06-20杨再林

检验医学与临床 2018年11期
关键词:血细胞形态学淋巴瘤

杨再林,刘 灵,叶 枫,张 勇△

(中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院:1.血液病中心;2.预防保健科,重庆 400038;3.中国人民解放军陆军军医大学预防医学系毒理学研究所,重庆 400038)

在2008年的WHO造血与淋巴组织肿瘤分类标准中,将侵袭性自然杀伤细胞(NK细胞)白血病(ANKL)与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL)、慢性NK细胞淋巴增殖性疾病(CLPD-NK)统一归类为成熟NK细胞肿瘤。对起源于未成熟的NK细胞肿瘤,如髓系NK前体细胞白血病和前体NK-淋巴母细胞淋巴瘤/白血病归为白血病范畴[1]。ANKL临床常表现为发热、肝脾肿大、黄疸、肝功能异常和全血细胞减少,疾病进展快,疗效差,短期内出现多脏器功能衰竭,中位生存期约为2个月[2]。由于对ANKL认识不足,临床易误诊、漏诊。ENKTCL好发于东亚、墨西哥和中美洲,欧美国家相对罕见,我国较多见。ENKTCL常见于成年人,男性稍多,以结外病变为主,主要侵及鼻或面中线部,临床呈高度侵袭性,发病与EB病毒(EBV)密切相关[1]。CLPD-NK是起源于成熟NK细胞系的恶性淋巴细胞增殖性疾病,较难确认CLPD-NK中NK细胞的克隆性,临床上常常呈惰性,与反应性NK细胞增多难以鉴别[3]。本研究回顾性分析2012年1月至2017年2月经中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院确诊的15例伴骨髓浸润(MBI)的成熟NK肿瘤患者的临床资料,对其临床特征与相关血液学指标及预后进行分析,为临床诊治提供更全面的依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 以2012年1月至2017年2月经中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院确诊收治的初诊为伴MBI的成熟NK细胞肿瘤患者15例作为研究对象,其中ANKL患者6例,ENKTCL-MBI患者7例,CLPD-NK患者2例;男12例,女3例;年龄17~60岁,中位年龄41岁。按照2008年WHO造血与淋巴组织肿瘤分类标准[4],并经流式细胞术检测符合CD56+、CD4-,无TCRγδ及TCRαβ表达,无T系、B系和髓系特异性标志表达,并出现抗原异常表达及克隆性增生的NK细胞来源的肿瘤细胞。按Ann Arbor分期系统进行临床分期,本组病例中NK/T细胞淋巴瘤MBI均为病理明确诊断NK/T淋巴瘤后经骨髓穿刺细胞形态学及流式细胞术检测诊断为ENKTCL-MBI病例。

1.2方法

1.2.1骨髓涂片 骨髓涂片按常规进行,必要时加做铁染色和POX染色。根据不同病理类型的成熟NK细胞肿瘤形态、大小及分化程度不同,参照FAB对ALL-L1型与ALL-L2型细胞大小划分原则(6~12 μm为小细胞,>12~25 μm为大细胞)及形态学通用的分类办法(主要依据核仁的有无、染色质聚集及核形规则程度综合判断),将骨髓中成熟NK细胞肿瘤形态分为3种类型:(1)原始大细胞型,细胞以大细胞为主,核圆形或类圆形,核形较规则,核染色质较细致,呈颗粒状,细胞质丰富,染色浅蓝,部分可见较细小嗜苯胺蓝颗粒,核仁大而明显。(2)幼稚不规则细胞型,细胞大小不等,体积差异在2倍以上,较悬殊,大者可表现为中等大或巨大,多核不规则样,核畸变明显,呈凹陷、折叠、扭曲状,核染色质粗细不定,易见瘤状突起和伪足,染色较蓝,核仁可见一个或多个;小者如淋巴组织样细胞,体积小,核呈圆形或类圆形,较规则,染色质成熟,胞浆少量,可见伪足,核仁不明显。(3)成熟小细胞型,以成熟小淋巴细胞为主,核圆形较规则,核染色质呈粗糙块状,细胞质量小,染色浅蓝,可见少量较粗大的嗜苯胺蓝颗粒,核仁不明显。

1.2.2骨髓活检 骨髓活检按常规进行,必要时加做网硬蛋白纤维染色等。

1.2.3多参数流式细胞术检测 采用荧光素标记的单克隆抗体及流式细胞仪检测细胞抗原的表达、细胞大小、细胞内颗粒多少,从而识别正常与异常细胞。仪器采用美国BD公司FACS Calibur型4色流式细胞仪,采用Cellquest流式荧光定量分析软件进行分析。每份标本分析10 000个细胞。采用荧光标记的单克隆抗体包括T、B、髓细胞系列及分化发育的抗体。其抗体有:sCD3、CD8、CD4、CD2、CD7、CD5、CD10、CD19、CD20、CD33、CD13、CD117、CD15、CD11b、CD56、HLA-DR、CD34、CD14、CD16、CD158b、CD94、CD161、CD57、cCD3、cCD79a、cMPO、CD38、CD138、CD30、Ki-67、TCRγδ、TCRαβ、CD45。单克隆抗体和配套试剂为美国BD公司产品。方法按流式细胞术检测常规进行。

1.3观察指标

1.3.1诊断符合率 观察骨髓涂片异常细胞比例与流式细胞术检测肿瘤细胞比例的差异,观察骨髓涂片形态学与流式细胞术检测的诊断符合率。

1.3.2骨髓形态及病理特征 观察骨髓涂片形态学特征、骨髓活检病理改变及网硬蛋白纤维增生情况。

1.3.3临床表现 包括体温、出血、肝、脾、淋巴结等。

1.3.4相关血液学指标 包括血常规、肝肾功能、凝血功能、EBV等。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,计数资料以例数或百分率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1临床表现 15例患者临床特征见表1。6例ANKL患者表现为发热、盗汗、体质量减轻,伴有不同程度的肝、脾和淋巴结肿大,5例伴有肺部感染,2例伴有噬血细胞综合征,1例伴有消化道出血。7例ENKTCL-MBI患者3例有不同程度的肝、脾肿大,4例有不同程度的淋巴结肿大,2例伴有噬血细胞综合征,6例表现为发热并合并肺部感染,1例伴有肉眼血尿。2例CLPD-NK患者未见明显肝、脾、淋巴结肿大,无发热表现。

2.2实验室检查

2.2.1ANKL患者和NKTCL-MBI患者血常规检测结果比较 见表2。2例CLPD-NK患者白细胞(WBC)分别为15.15×109/L、27.92×109/L,WBC分类以淋巴细胞增高为主,符合该类型淋巴细胞明显增加的特点;血红蛋白(Hb)分别为130、141 g/L,血小板(PLT)分别为25×109/L、163×109/L。6例ANKL患者及7例ENKTCL-MBI患者血常规均呈不同程度全血细胞减少,差异无统计学意义(P>0.05)。2例CLPD-NK患者血常规白细胞数明显高于ANKL及ENKTCL-MBI患者。

表1 15例成熟NK细胞肿瘤患者临床特征

表2 ANKL患者和ENKTCL-MBI患者血常规检测结果比较

注:Neu#表示中性粒细胞,RBC为红细胞

2.2.215例成熟NK细胞肿瘤患者血液生化情况 见表3。6例ANKL患者及7例ENKTCL-MBI患者均有不同程度的肝功能损害及乳酸脱氢酶(LDH)升高,部分患者有不同程度的凝血功能异常,少部分患者有肾功能损害,但差异无统计学意义(P>0.05)。而2例CLPD-NK患者均无明显肝功能损害、LDH升高、肾功能损害及凝血功能异常,与ANKL及ENKTCL-MBI患者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 15例成熟NK细胞肿瘤患者血液生化情况(n)

图1 病例1 ANKL细胞形态(原始大细胞型)

图2 病例12 ENKTCL-MBI细胞形态(幼稚不规则细胞型)

2.2.3骨髓形态及病理特点 按骨髓成熟NK细胞肿瘤形态三分类方法,骨髓形态及病理特点见图1~3。6例ANKL患者中原始大细胞型2例,幼稚不规则细胞型4例;7例ENKTCL-MBI患者中幼稚不规则细胞型6例,成熟小细胞型1例;2例CLPD-NK患者均为成熟小细胞型。ANKL与ENKTCL-MBI患者中各有2例伴有数量不等的噬血细胞,见图4。15例有MBI的成熟NK细胞肿瘤患者骨髓活检均检出呈结节状或片簇状肿瘤细胞,6例ANKL患者中3例伴有骨髓纤维组织增生,7例ENKTCL-MBI患者中4例伴有骨髓纤维组织增生。

图3 病例14 CLPD-NK细胞形态(成熟小细胞型)

图4 病例1噬血细胞

2.2.4流式免疫表型与EB-DNA检测结果比较 15例患者EB-DNA检测9例阳性,1例阴性,5例未测。15例患者流式免疫表型均为CD56+,并且有CD4-、CD5-、CD57-、TCRγδ-及TCRαβ-,15例患者抗体阳性率依次为CD2:93.33%(14/15)、CD94:86.67%(13/15)、CD7:73.33%(11/15)、cCD3:66.67%(10/15)、CD161:53.33%(8/15)、CD16:40.00%(6/15)、CD8:26.67%(4/15)、CD158b:20.00%(3/15)。CD16在ANKL中的阳性率为83.33%(5/6),在ENKTCL-MBI中均为阴性,差异有统计学意义(P<0.05)。Ki-67在ANKL中平均表达水平为81.00%,表达水平最高,在ENKTCL-MBI中平均表达水平为72.00%,略低于ANKL患者,在CLPD-NK中平均表达水平最低,为20.00%。CLPD-NK与ANKL及ENKTCL-MBI比较,Ki-67表达水平差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 15例成熟NK细胞肿瘤患者抗原表达差异(%)

2.3形态学与流式细胞术诊断符合率 15例伴MBI的成熟NK细胞肿瘤患者中,当骨髓细胞形态学异常细胞比例在5%~20%时,流式细胞术检测中肿瘤细胞比例明显高于骨髓细胞形态学,差异有统计学意义(P<0.05)。6例ANKL患者中,1例原始大小型骨髓细胞形态学初诊误诊为急性骨髓性白血病,形态学与流式细胞术检测的诊断符合率为83.33%(5/6);另5例ANKL患者及7例ENKTCL-MBI患者骨髓细胞形态学虽不能明确细胞类型,但均提示为MBI;1例CLPD-NK患者初诊误诊为慢性淋巴细胞白血病(CLL),形态学与流式细胞术检测的诊断符合率为50.00%(1/2);另1例CLPD-NK患者骨髓细胞形态学不能明确细胞类型,提示CLPD。

2.4治疗及预后 针对原发病治疗及给予对症支持治疗,6例ANKL患者中2例放弃治疗,4例患者采用SMILE、COP+表柔比星等化疗方案治疗1个疗程后均未获得完全缓解,分别在1~4个月内死亡。7例ENKTCL-MBI患者中,4例放弃治疗,3例分别采用MESA+长春地辛、CHOD+培门冬酶等化疗方案治疗,治疗效果不佳,分别在1~9个月内死亡。2例CLPD-NK患者中,1例在随访13个月后病情加重,进展成ANKL后放弃治疗,在1个月内死亡,另1例仍存活,目前已随访27个月,病情无进展。

3 讨 论

2008年WHO分类标准将ANKL、ENKTCL与CLPD-NK一起归入成熟NK细胞肿瘤,对于ANKL与CLPD-NK的诊断,国内外尚无统一的诊断标准,主要依据临床特点、细胞形态、免疫学表型及细胞遗传学与分子遗传学等特征综合考虑[1]。淋巴瘤MBI时,判断标准按国内勇氏诊断标准,骨髓中瘤细胞数大于或等于5%时,诊断为MBI,瘤细胞数大于或等于20%时,诊断为淋巴细胞白血病[5]。

ANKL临床较少见,本组ANKL患者均起病急、进展快,临床呈侵袭性和暴发性,均表现为发热、盗汗、体质量减轻,伴有不同程度肝、脾和淋巴结肿大,部分病例伴有肺部感染及噬血细胞综合征。均有一系或多系血细胞减少及不同程度的肝功能损害,LDH升高及EB-DNA检测阳性,与文献[6]报道一致。ENKTCL占所有非霍奇金淋巴瘤的5%~15%,80%以上结外NK/T细胞淋巴瘤原发于鼻腔,主要累及淋巴结外组织,如皮肤、胃肠道、骨髓等。发生在鼻腔外的ENKTCL具有高度侵袭性,预后较差[7]。本组部分ENKTCL-MBI患者有不同程度的肝、脾、淋巴结肿大及伴有噬血细胞综合征,以及不同程度凝血功能异常,多数表现为发热合并肺部感染,均有不同程度的一系或多系血细胞减少,有不同程度肝功能损害及LDH升高。本组CLPD-NK患者白细胞明显升高,以淋巴细胞增殖为主,未见明显肝、脾、淋巴结肿大,无发热表现,明显不同于ANKL与ENKTCL的高侵袭临床过程。由于ANKL、ENKTCL-MBI时,以及CLPD-NK发生时流式细胞术检测均会出现异常表型NK细胞,需要结合临床表现及实验室检查进行鉴别。

骨髓细胞形态学及骨髓活检是血液系统肿瘤及淋巴瘤MBI诊断最常用的检查方法之一,但由于NK细胞肿瘤形态多样,且单纯通过形态很难准确区分和鉴别。本研究首次将成熟NK肿瘤细胞根据其骨髓涂片细胞形态特征分为3种类型,ANKL可以出现原始大细胞型,ENKTCL-MBI以幼稚不规则型为主,CLPD-NK以成熟小细胞型为主。据此形态学分类方法,可以给临床诊断与鉴别诊断及进一步检查提供思路与方向。ANKL及ENKTCL-MBI患者骨髓活检中肿瘤细胞呈大片状或结节状分布,约50%以上的ANKL及ENKTCL-MBI患者骨髓存在纤维组织增生。骨髓异常细胞比例在5%~20%时,形态比例与流式细胞术检测比例差异有统计学意义,分析其导致差异的原因是:在幼稚不规则细胞型时,由于体积大小悬殊的细胞存在,往往容易忽略体积较小的一群细胞而导致形态学肿瘤细胞比例明显低于流式细胞术检出比例。CLPD-NK患者骨髓多为成熟小淋巴细胞型,形态上应注意和CLL鉴别。本组流式细胞术检测结果还显示,CD56、CD2、CD94在成熟NK细胞中阳性率较高,CD16在ANKL中阳性率明显高于ENKTCL-MBI,由此提示在ANKL与ENKTCL-MBI的鉴别诊断时有一定价值。Ki-67在ANKL与ENKTCL-MBI中无明显差异,但与CLPD-NK有明显差异,Ki-67阳性率的升高可以作为疾病侵袭性增加的依据。形态和流式细胞术检测结果相结合,可以对NK细胞肿瘤作出较准确的病理分型诊断与鉴别。

根据文献[1]及本组资料显示,ANKL与ENKTCL-MBI鉴别点如下:(1)免疫表型,CD16在ENKTCL-MBI中阳性率明显低于ANKL,可作为鉴别点之一。(2)临床特点,80% ENKTCL病例累及鼻和鼻旁组织并易侵犯皮肤,而ANKL的鼻和鼻旁组织及皮肤侵犯少见,也可作为二者的鉴别点。(3)骨髓细胞形态,ENKTCL骨髓侵犯时,骨髓形态以细胞大小混杂的幼稚不规则细胞型为主,当形态为原始大细胞型时,结合流式的NK细胞免疫表型可作出更倾向于ANKL的诊断,亦可以作为潜在的鉴别点,该观点在既往研究中少有报道。由于CLPD-NK临床表现为惰性,明显不同于ANKL与ENKTCL的高侵袭临床过程,并且CLPD-NK外周血NK细胞绝对值≥2×109/L持续6个月以上,据此可以和ANKL及ENKTCL相鉴别。少数患者出现血细胞减少、皮肤脉管炎、周围神经病变和脾脏肿大及急性肾小球肾炎等,但也可能进展为侵袭性NK细胞白血病[8]。由于难以确认CLPD-NK中NK细胞的克隆性,临床上排除继发性NK细胞增多仍比较困难。根据文献[9-11]报道,确认NK细胞的克隆性有以下方法:(1)KIRs的限制性表达可能作为CLPD-NK的克隆性证据。(2)30%的CLPD-NK患者存在STAT3基因突变,并提示可能预后更差,可以与反应性NK细胞鉴别。(3)CLPD-NK有与正常NK细胞明显不同的免疫表型。本组资料中2例CLPD-NK患者初诊时均出现无诱因的白细胞持续性增高,形态以含有颗粒的成熟小淋巴细胞为主,流式检测均为异常成熟NK细胞表型,未见明显肝、脾、淋巴结肿大。其中1例已随访27个月,未给予任何特殊干预措施,病情无进展。另1例初诊误诊为CLL,经流式检测后修正诊断,随访13个月后出现发热、肝肾功能异常、LDH增高、凝血功能异常等,疾病进展为ANKL后放弃治疗,1个月后患者死亡,提示该类疾病虽然病程偏惰性,仍需密切随访。

本组ANKL患者治疗效果欠佳,均在4个月内死亡,符合ANKL疾病进展迅猛、预后差的临床特点。本组ENKTCL-MBI患者在治疗1~9个月内死亡,疾病进展略慢于ANKL。本组资料中,绝大多数ANKL及ENKTCL-MBI患者有高热,肝、脾、淋巴结肿大等体征,绝大多数有不同程度的全血细胞减少及LDH升高。有研究报道,采用联合化疗及造血干细胞移植能延长患者生存期[12-13]。CLPD-NK往往呈现白细胞及淋巴细胞比例增高,临床表现更惰性,不同于ANKL与ENKTCL的高侵袭临床过程,但仍可能进展为ANKL。由于骨髓形态多样、极不典型,结合患者临床表现、血常规情况、骨髓细胞形态分类特征及流式检测能提高其诊断符合率,提高对该病的认识,做到早期诊断及鉴别诊断,才能为进一步治疗赢得时间。

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