荧光探针偶联GPC3单链抗体对肝癌的体内外检测研究

杜恩辅，徐 霖，周选民，刘梅讯，张晓龙，崔 宁，侯平志，余惠芬

(湖北医药学院附属十堰市太和医院医学影像中心 442000)

肝细胞癌(HCC)是最常见的肝癌亚型，发病率占全球第5位[1]，HCC确诊后的5年生存率不足12%[2]。分子靶向药物为肝癌治疗提供了新的策略[3-4]，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)3是肝素硫酸多糖家族的一个膜蛋白[5]。自1997年有学者首先发现GPC3的mRNA在HCC组织中高度表达后，多个研究团队对GPC3的生物学特性进行分析发现，GPC3在超过70%的HCC中表达，在正常肝组织中不表达[6-7]。因此，GPC3是一种肿瘤特异性抗原，在肿瘤分子免疫靶向治疗方面有重要应用前景。基于GPC3的高表达，罗氏公司研发出Codrituzumab成为GPC3阳性肝癌的潜在治疗手段[8]。本研究以GPC3为靶点设计了单链抗体，并将单链抗体与荧光染料结合，使其在体内外对GPC3阳性肿瘤都有很好的靶向性，并使其生物相容性增加，半衰期延长，为实验室研究或临床检测提供了新的手段与技术 ，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 DMEM培养基购自Life公司；蛋白Marker购自美国伯乐公司；异硫氰酸荧光素(FITC)偶联羊抗人IgG-Fc单克隆抗体购自南赛博生物公司；胎牛血清(FBS)购自美国Invitrogen公司；罗丹明B荧光染料购自上海碧云天公司； Balb/c裸鼠购自南京大学模式动物所；(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自南京晚晴公司；活性近红外荧光基团(NIRB-NHS)试剂盒购自上海科远迪生物科技有限公司；细胞培养瓶及相关培养耗材购自美国热电公司。

1.2方法

1.2.1融合蛋白表达及纯化 通过GeneBank数据库搜索Codrituzumab轻链与重链可变区蛋白序列，使用G4S柔性肽将二者连接在一起，并通过毕赤酵母偏爱密码子优化后送公司合成，导入工程质粒中。采用毕赤酵母X-33表达系统，发酵液经硫酸铵沉淀法初步提取后采用镍柱进一步分离纯化得到电泳纯蛋白，最后利用Western Blot对纯化得到的蛋白进行鉴定，以期获得高产量、高纯度的融合蛋白。

1.2.2流式细胞术 制备Huh-7单细胞悬液，细胞数在106个/组。分为单链抗体组和脱脂牛奶空白对照组。每组分别加入250 μL相应的抗体或脱脂牛奶，抗体浓度为200 μg/mL，冰上孵育1 h，洗涤，孵育鼠抗His抗体，洗涤，再孵育FITC-偶联的羊抗人IgG抗体，洗涤，上机检测。使用FlowJo 7.6.1对流式数据进行处理。

1.2.3激光共聚焦体外成像试验 取罗丹明B 4.79 mg溶于1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)(pH为7.2)中，加入EDC、NHS，摩尔比罗丹明B∶EDC∶NHS=1.0∶1.1∶1.2，避光反应4 h，活化。反应后溶液再加入一定量的单链抗体(scFv)，摩尔比罗丹明B∶scFv=1.0∶1.2，继续避光搅拌反应，6 h后停止反应得到产物粗品。使用超滤管纯化，5 000 r/min离心10 min。将1 mL罗丹明B-scFv加入到已培养24 h的Huh-7细胞中，37 ℃孵育2 h，以PBS洗2遍即可使用激光共聚焦观察内吞情况。

1.2.4近红外体内成像试验 本研究分为两组，试验组为Anti-GPC3 scFv组，另设置一个探针封闭组(Blocking组)。首先制备NIRB-Anti-GPC3 scFv荧光探针，将1 mg NIRB-NHS粉末溶于100 μL的DMSO中，浓度为0.01 mg/μL；将配制好的染料立即逐滴加入保存于含有Anti-GPC3 scFv(水平为10 mg/mL)的PBS中，放至摇床室温反应2 h；反应结束后，将反应液加入超滤管中进行超滤，4 000 r/min 离心30 min，重复3次，取超滤管上层溶液，冻干可得到标记近红外线荧光探针(IRB)的相应固体粉末。Blocking组是将荧光探针NIRB-Anti-GPC3 scFv与Anti-GPC3 scFv按物质的量1∶50混合制备Blocking组探针，终浓度为50 μmol/L。建立Huh-7荷瘤小鼠动物模型，收集对数生长期Huh-7细胞，1 000 r/min离心3 min后用生理盐水重悬，调整细胞密度为5×106个/mL，取200 μL细胞悬液接种于裸鼠左侧腋皮下。待肿瘤体积接近80 mm3，经尾静脉注射试验组探针及 Blocking 组探针100 μL。注射0、4、8、12 h后，分别对两组小鼠进行近红外成像拍照。使用CCD照相机实时收集荧光信号，对结果拍照并分析。

2 结 果

2.1单链抗体Anti-GPC3 scFv的WB验证及亲和力验证 见图1。Codrituzumab轻链与重链可变区蛋白序列通过PCR将二者采用G4S柔性肽连接在一起并导入工程质粒中，毕赤酵母X-33进行表达。经过硫酸铵沉淀法和镍柱纯化得到单链抗体Anti-GPC3 scFv，并进行WB验证，Anti-GPC3 scFv的相对分子质量为28×103。获得了纯度较高且装配正确的单链抗体Anti-GPC3 scFv。

注：A为WB验证单链抗体Anti-GPC3 scFv相对分子质量；M为蛋白marker；1为纯化的单链抗体Anti-GPC3 scFv； B为单链抗体Anti-GPC3 scFv与Huh-7细胞的结合验证

图1单链抗体Anti-GPC3 scFv的WB验证及亲和力验证

2.2Anti-GPC3 scFv与Huh-7细胞结合率 抗GPC3的单链抗体Anti-GPC3 scFv能有效结合到HCC Huh-7细胞表面。Anti-GPC3 scFv与Huh-7细胞的结合率为40.3%，表明制备的单链抗体Anti-GPC3 scFv仍然保留有母体抗体的结合活性。

2.3激光共聚焦试验验证Anti-GPC3 scFv的体外靶向性 见图2。通过激光共聚焦成像试验验证单链抗体Anti-GPC3 scFv的体外靶向性，其可在体外很好地靶向HCC Huh-7细胞。在单链抗体与荧光染料罗丹明B偶联后，经过与Huh-7细胞2 h孵育，通过激光共聚焦成像观察并拍摄了细胞水平的成像照片，并通过Image J软件对图片进行分析。试验结果表明，单链抗体组细胞平均荧光强度为218.61±9.03，明显优于阻断对照组的31.74±5.28。通过激光共聚焦试验可以确定设计的单链抗体Anti-GPC3 scFv与罗丹明B偶联后可很好地进行HCC Huh-7细胞的体外检测，为进一步体内靶向性试验奠定基础。

图2 激光共聚焦试验验证Anti-GPC3 scFv的体外靶向性

2.4近红外成像试验验证Anti-GPC3 scFv的体内靶向性 见图3。本试验使用NIRB-NHS试剂盒将荧光基团与抗单链抗体Anti-GPC3 scFv偶联，制成NIRB-Anti-GPC3 scFv荧光探针，通过近红外成像系统对NIRB-NHS定位，观察抗体的体内靶向性。从试验结果可以发现，尾静脉注射NIRB-Anti-GPC3 scFv后，单链抗体首先由尾静脉进入心脏；4 h时单链抗体在全身弥散并开始经膀胱代谢，肿瘤组织有Anti-GPC3 scFv富集，其他组织无富集；6～12 h时体内Anti-GPC3 scFv经膀胱代谢逐渐减少，在8 h时肿瘤组织仍有微弱富集。从Blocking试验可以看出，NIRB-Anti-GPC3 scFv的靶向效果可被Anti-GPC3 scFv竞争性抑制。试验组与 Bolcking组在注射后8 h时肿瘤组织的荧光信号与正常组织荧光信号比值分别为8.27±2.94和1.09±0.63，差异有统计学意义(P<0.05)。体内近红外试验验证了Anti-GPC3 scFv的体内靶向性，其可以在体内准确地靶向HCC，有开发为检测试剂的潜能。

图3 近红外成像试验验证Anti-GPC3 scFv的体内靶向性

3 讨 论

近年来，医学与生命科学交叉应用的关键技术——科学医学影像学成为临床检测的研究重点。随着荧光成像技术的逐渐发展，其在细胞成像、心血管成像、近红外荧光分析、微量生物活性物质检测等生物医学工程领域被广泛应用[9]，尤其在肿瘤成像领域有很好的前景。但是大多数荧光试剂的相对分子质量较小，靶向性差，并且在体内半衰期短，很难达到检测要求。GPC3是HCC研究的热门靶点，其在HCC肿瘤细胞表面呈高表达，与肿瘤的发生和发展有关，其主要在原发性HCC及癌旁组织中表达,没有发现其在良性肝病肝细胞、胆管细胞癌及正常肝组织中表达[10]。由于GPC3在HCC中呈高表达，其有很大的潜力开发成为一种试验和临床检测的靶点[11]。与原核细胞展示型抗体库相比,采用哺乳动物抗体库筛选获得的修饰后单链抗体相对于原核细胞抗体库有更好的低免疫原性和特异性。此外，全长抗体比单链抗体的稳定性及半衰期更高、更长,其Fc段可以和靶细胞Fc段结合,从而激活补体介导的细胞免疫[12-13]。因此,全长全人源的抗GPC3抗体在原发性HCC的诊断和治疗上有巨大潜力。

由于单链抗体相对于全长抗体的优势在于其相对分子质量较小，生产成本较低，并且拥有更好的体内外渗透性，故在检测领域拥有较好的应用价值。通过单链抗体与荧光染料的偶联，不仅可以发挥单链抗体较强的靶向能力，还可应用荧光探针检测的方便与准确，同时克服荧光染料在体内靶向性差和半衰期短等问题，是一种很好的检测手段，具有研究价值和开发潜力[14]。因为GPC3特异地表达在HCC细胞表面，而临床研究显示，使用单克隆抗体靶向GPC3可引发抗体依赖的细胞毒反应。Codrituzumab作为罗氏公司开发的全长全人源抗GPC3抗体，可有效治疗GPC3阳性HCC。有研究发现，在药物暴露剂量、外周血免疫细胞表达CD16及GPC3高表达的肿瘤患者中，Codrituzumab可以延长无进展生存期或总生存期，且Codrituzumab没有显示出特殊的毒副作用[15]。

本研究成功构建并表达单链抗体Anti-GPC3 scFv，并进行了Anti-GPC3 scFv体内外靶向性验证，流式细胞结合试验结果显示，单链抗体Anti-GPC3 scFv对HCC Huh-7细胞保持很好的体外结合能力。同时体外激光共聚焦试验验证了单链抗体Anti-GPC3 scFv与罗丹明B偶联后可很好地对HCC Huh-7细胞进行靶向，并且荧光效果明显，可以作为体外HCC细胞检测的重要手段。通过进一步的体内试验，本研究将单链抗体Anti-GPC3 scFv与NIRB-NHS进行偶联，获得了在体内也拥有荧光活性的单链抗体。试验结果表明，单链抗体Anti-GPC3 scFv可以很好地在体内靶向HCC细胞，并且通过成像手段检测到清晰的荧光信号。

综上所述，相对于单纯的单链抗体或荧光染料，本研究设计的单链抗体Anti-GPC3 scFv偶联荧光染料的探针可以很好地对HCC细胞进行体内外靶向。这种偶联手段简单易行，而且荧光信号较强，可以作为试验检测或临床检测的手段，有进一步开发的潜力。

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