CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞与2型糖尿病肾病的相关性研究*

李小峰，廖 静

(1.广东省深圳市龙岗区人民医院检验科 518172；2.广东省深圳市龙岗区疾病预防控制中心 518172)

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病，随着经济的发展已经成为三大严重威胁人类健康的疾病之一[1]。糖尿病以1型和2型为主，其中2型糖尿病约占95%。由于其起病隐匿，病程缓慢，患病初期多无明显症状，经常在发生不可逆的并发症时才引起重视。糖尿病肾病(DKD)是2型糖尿病患者常见的严重并发症之一，主要病理特征为肾小球硬化，由多种因素共同作用所致[2-3]。有研究表明，机体的细胞免疫调节异常可能在DKD的发病过程中起重要作用[4-7]。叉头转录因子3(FOXP3)是调节性T细胞(Treg)发育和功能的必须因子，对维持免疫耐受有重要作用，因而其在DKD病程中的作用也备受关注[8-10]。本研究拟探讨2型糖尿病不同病程中CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率与DKD的关系，旨在阐明2型糖尿病及DKD潜在的发病机制，为疾病诊治提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 以2015年7月1日至2016年12月30日在深圳市龙岗区人民医院就诊的健康体检者和2型糖尿病患者120例作为研究对象。参考《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》标准，依据血糖代谢状态、24 h尿蛋白排泄率(UAER)等指标并结合确诊病历信息，将研究对象分为对照组、糖尿病前期组、糖尿病无肾病组、DKD组，每组各30例。对照组男15例，女15例，平均年龄(37.2±12.6)岁，见表1。

表1 研究对象分组及依据

注：-表示无数据

1.2排除标准 肿瘤，妊娠，除DKD以外的其他肾脏疾病、泌尿系统炎症、结石、急慢性炎症性疾病、严重肝病、严重心血管疾病及6个月内发生过心肌梗死、心绞痛、脑梗死等心脑血管事件，血液系统疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病。

1.3试剂与方法

1.3.1外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率 采用美国BD公司Anti-Human Foxp3 Staing试剂盒(BD560132)，内含抗CD4-FITC抗体、抗CD25-PE抗体和抗Foxp3-Alexa Fluor抗体，采用美国BD公司流式细胞仪测定。

1.3.2UAER 入选糖尿病患者2日内避免剧烈运动，正常饮食，记录24 h尿量，取晨尿标本10 mL送检，采用全自动生化分析仪检测。

1.3.3糖化血红蛋白(HbA1c) 采用美国BD公司血红蛋白测试系统，以高压液相色谱法检测糖尿病患者全血中HbA1c。参考2010年美国糖尿病学会制定的糖尿病诊断标准，结合仪器运行实际情况，将全血HbA1c的正常范围确定为3.8%～5.8%。

1.3.4空腹血糖(FPG)、血脂4项测定 FPG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)采用全自动生化分析仪检测。

2 结 果

2.1各组研究对象基本情况比较 各组研究对象基本资料见表2。各组患者在性别、TC、LDL-C方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，而在年龄、HbA1c、FPG、TG和HDL-C方面比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组研究对象基本情况比较

注：与对照组比较，#P<0.05；与糖尿病前期组比较，*P<0.05

2.2各组研究对象CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率比较 见表3。各组之间CD4+CD25+T细胞表达率不同，差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组比较，糖尿病前期组、糖尿病无肾病组、DKD组CD4+CD25+T细胞表达率均下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达在各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。DKD组CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达明显低于对照组、糖尿病前期组和糖尿病无肾病组(P<0.05)，但对照组和糖尿病前期组之间CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达与其他指标的相关性 见表4。相关性分析显示，CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达与研究对象年龄、HDL-C、TC、LDL-C之间无线性相关(P>0.05)，HbA1c、FPG、TG、糖尿病病程与CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率之间呈负相关(P<0.05)。

表3 各组别研究对象外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率比较

注：与对照组比较，#P<0.05；与糖尿病前期组比较，*P<0.05；与糖尿病无肾病组比较，△P<0.05

表4 CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达与其他指标的相关性

3 讨 论

目前，DKD已成为慢性肾衰竭的主要病因，也是糖尿病患者的主要死因之一。有研究表明，DKD患者外周血中补体3、补体4、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD3+T细胞、CD4/CD8、B细胞和自然杀伤细胞均比健康人高[11]。提示DKD患者体内存在体液免疫和细胞免疫功能紊乱的现象。解晓琴等[5]的研究表明，单纯糖尿病组与糖尿病伴肾病组比较，CD4/CD8及CD3+T细胞、CD4+T细胞表达率差异均有统计学意义(P<0.05)，提示2型糖尿病患者存在明显的免疫系统稳态失衡，在肾损伤不同阶段细胞免疫发挥重要作用。

Treg细胞是一类具有较强免疫调节作用的T淋巴细胞亚群。根据Treg细胞作用机制和表面标记不同可分为自然Treg(即CD4+Treg)和适应性Treg，其中CD4+CD25+Treg细胞是自然Treg细胞亚类的主要部分，占外周血CD4+T细胞的5%～10%，具有免疫抑制性和免疫无能性，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面有极为重要的作用[11]。但CD4+CD25+T细胞包含Foxp3 Treg细胞、1型Treg细胞、活化效应T细胞和3型辅助性T细胞，各种分型作用不同，无法反映体内Treg的真实水平[12-13]。Foxp3是脊椎动物叉头样转录因子，特异表达于CD4+CD25+Treg细胞，不仅是CD4+CD25+Treg细胞发育的关键因子，也是Treg细胞的特征性标志，因此，CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率能更准确地反映CD4+CD25+Treg细胞的活性。

本研究结果发现，各组CD4+CD25+T细胞表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，糖尿病前期组、糖尿病无肾病组、DKD组CD4+CD25+T细胞表达均低于对照组。张小娇等[14]研究发现，2型糖尿病患者CD4+CD25+T细胞表达低于健康志愿者，与本研究结果一致。但本研究中糖尿病前期组、糖尿病无肾病组、DKD组之间CD4+CD25+T细胞表达差异并无统计学意义。与对照组和糖尿病前期组比较，CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达率差异有统计学意义(P<0.05)，DKD组CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达明显低于其他各组，而糖尿病无肾病组CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达低于对照组和糖尿病前期组，糖尿病前期组低于对照组，但差异并无统计学意义(P>0.05)。袁宁[15]的研究表明,初诊糖尿病患者CD4+CD25+T细胞表达明显低于健康对照组，与本研究结果相同。上述CD4+CD25+T细胞表达和CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达不同步的现象可以解释如下：在糖尿病前期，虽然糖耐量受损患者体内CD4+CD25+T细胞表达有所减少，但Foxp3+Treg细胞的表达并无改变，随着病程发展，在2型糖尿病发生至DKD的过程中，患者体内可溶性IL-2受体堆积，导致IL-2对T细胞作用下降，影响T细胞增殖，进而导致Treg细胞生成障碍，CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达降低，推测CD4+CD25+Foxp3+T细胞异常可能是DKD发生的原因之一[14-15]。为探索CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达降低的原因，本课题组将进一步对DKD患者FOXP3基因启动子区甲基化水平开展研究。

综上所述，研究对象外周血中 CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达与糖尿病病程呈负相关， 2型糖尿病患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞表达降低，导致其介导的免疫耐受减弱，对抗内皮细胞抗体激活自身免疫反应的调节功能也随之下降，可能导致DKD加重。因此，在DKD诊治过程中，应关注机体细胞的免疫状态[16-17]。

[1]舒成，肖志霞.糖尿病治疗药物的研究进展[J].科技视界,2016，6(13):278-280.

[2]李俊燕，谭英姿，冯国鄞，等.糖尿病肾病遗传学研究进展[J].遗传,2012,34(12):1537-1544.

[3]刘雪峰，张睿.糖尿病肾病与细胞因子的相关性研究进展[J].河北医药,2016,38(21):3323-3326.

[4]杨丕坚，李舒敏，吕以培，等.糖尿病肾病患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及其与肾血管内皮功能障碍的关系[J].中国全科医学,2011,14(33):3779-3781.

[5]解晓琴，毛达勇，孙竞，等.2型糖尿病肾病患者免疫相关因素分析[J].郧阳医学院学报,2010,29(1):48-49.

[6]PICKUP J C.Inflammation and activated innate immunity in the pathogenesis of type 2 diabetes[J].Diabetes Care,2004,27(3):813-823.

[7]唐灵，陈春莲，苏桂兰，等.2型糖尿病肾病患者内脂素、脂联素和C反应蛋白变化及其临床意义[J].中国全科医学,2011,14(23):2616-2619.

[8]FONTENOT J D,GAVIN M A,RUDENSKY A Y.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].J Immunol,2017,198(3):986-992.

[9]KHATTRI R,COX T,YASAYKO S A,et al.An essential role for Scurfin in CD4+CD25+T regulatory cells[J].J Immunol,2017,198(3):993-998.

[10]张曦，杜薇蓓，于璐，等.糖尿病患者微炎症及免疫状况与肾脏病变的关系[J].中国老年学杂志,2012,32(18):3883-3885.

[11]史国星，曾强，窦剑，等.CD4+C25+Foxp3+调节性T细胞在自身免疫性疾病中的研究进展[J].免疫学杂志,2016,32(12):1092-1095.

[12]LIU W,PUTNAM A L,XU-YU Z,et al.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+T reg cells[J].J Exp Med,2006,203(7):1701-1711.

[13]唐洁，李柏青，阮洁,等.新生儿脐带血CD4+CD25(high)调节性T细胞Foxp3的表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,24(4):365-367.

[14]张小娇，孔璐璐，顾榕，等.糖尿病患者外周血FOXP3+调节性T细胞的检测及其临床意义[J].南京医科大学学报(自然科学版),2012,32(4):509-513.

[15]袁宁.初诊2型糖尿病患者CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达及血清中相关细胞因子IL-10和TGF-β变化[D].长春：吉林大学,2011.

[16]ZHENG Q,XU Y,LIU Y,et al.Induction of Foxp3 demethylation increases regulatory CD4+CD25+T cells and prevents the occurrence of diabetes in mice[J].J Mol Med (Berl),2009,87(12):1191-1205.

[17]李小峰，廖静.糖化血红蛋白在不同季节、性别和年龄间的差异[J].职业与健康,2017,33(4):473-476.