过表达RSK4m1对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和侵袭的影响

郇雪洁 姬逸男 杨宁 伍越 朱玲钰 杨华伟

核糖体S6蛋白激酶4（ribosomal protein S6 kinase 4，RSK4）位于X染色体q21区域，是一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶［1］。研究表明，RSK4基因是抑癌基因，能抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及转移［2-3］。本课题组前期研究表明RSK4相关表达与乳腺癌细胞体外侵袭能力呈负相关，且在MDA-MB-231细胞系中表达最低［4］。可变剪接是指通过不同的剪接方式或在不同的剪接位点进行剪接，同一个前体mRNA可剪接成不同的基因表达亚型。RSK4通过可变剪接作用形成三种变异体［5］。可变剪接可产生蛋白质异构体调节胚胎发育、细胞分化和凋亡等重要过程［6］。前期研究发现部分RSK4变异体的相互作用蛋白还涉及肿瘤细胞的迁移和侵袭，推测RSK4的可变剪接变异体1（ribosomal protein S6 kinase 4 variant 1，RSK4m1）可能与RSK4有同样的生物学功能。本研究在人乳腺癌MDA-MB-231细胞系中过表达RSK4m1，观察该细胞系的增殖、迁移及侵袭等变化，探讨过表达RSK4m1对乳腺癌细胞MDA-MB-231功能学的影响，为明确RSK4m1对乳腺癌的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（上海）；阴性对照病毒LVCON145及RSK4m1慢病毒表达载体LV-RPS6KA6由上海吉凯基因技术有限公司构建包装；RSK4m1及GAPDH引物由广州艾基生物技术有限公司合成；抗RSK4、GAPDH单克隆抗体购于美国Abcam公司；Transwell小室（孔径8.0 μm）购于美国Corning公司；倒置相差显微镜购于OLYMPUS公司；酶标仪实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪购于美国Thermo公司；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养与转染

将MDA-MB-231细胞置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养。细胞密度长到90%左右，吸去培养基，PBS冲洗，胰酶消化2 min后常温离心，吸上清液，加入新鲜培养基吹打均匀后计数，将细胞悬液接种于6孔板中，每孔细胞数约为1×105个。细胞密度达70%左右时转染。将细胞设置为3组：以MDA-MB-231亲本细胞为空白对照组（Con组）、转染空载病毒的MDA-MB-231细胞为阴性对照组（Mock组）、转染过表达RSK4m1的MDA-MB-231细胞为实验组（OE组）。在MOI=15条件下，OE组加入LV-RPS6KA6病毒稀释液，Mock组加入LVCON145病毒稀释液，每组均设置3个复孔，每孔均加入终浓度为5 g/mL的Polybrene及感染增强液，终体积为1 mL。放入培养箱培养，12 h后观察细胞状态，更换新鲜培养基。分别于感染24 h、48 h和72 h后在倒置荧光显微镜（×40）下观察感染效率。

1.3qRT-PCR检测mRNA表达量

用Trizol提取总RNA，逆转录为cDNA。RSK4m1上游引物序列为5'-ATATGGACCCACATCAGCGG-3'，下游引物序列为5'-AGCAGCTACAGGCTCTAGGA-3'。内参GAPDH上游引物序列为5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物序列为5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明，每组为20 μL的Real-time PCR体系，每孔设3个复孔。反应条件：预变性95℃30 s，变性95℃5 s，退火60℃ 30 s，共40个循环。RSK4m1的mRNA相对表达量采用2-△△Ct计算，计算公式如下：△Ct=Ct平均值（RSK4m1）-Ct平均值（GAPDH），△△Ct=△Ct（Mock组或OE组）-△Ct（Con组）。实验重复3次。

1.4 Western Blot法检测蛋白表达量

收集对数期生长的细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定每组蛋白浓度。每孔蛋白上样量为25 μg，根据所测蛋白浓度，计算相应的上样体积。以10%SDS-PAGE电泳分离蛋白后转至PVDF膜，室温下5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入特异性抗体RSK4m1（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）4 ℃ 摇床过夜。TBST洗涤30 min后二抗室温孵育1 h。ECL显影，凝胶成像系统拍照并进行灰度值分析。蛋白相对表达量为RSK4m1与GAPDH蛋白条带灰度值的比值。实验重复3次。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

每组细胞以3×103个/孔接种于96孔培养板中，加入含10%FBS培养基使每孔液体总量为100 μL，每组设 6 个复孔，分别于 0 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h取3个复孔行CCK-8法检测，每孔加入10 μL CCK反应液，置于37℃培养箱继续培养1 h，测定450 nm处吸光度值（OD值）。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。记录各组0 h、24 h、48 h、72 h和96 h的OD值。实验重复3次。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

以标记笔于6孔板背面笔直划3或4条直线，每条直线间隔1 cm。取对数生长期细胞消化并接种于6孔板，3×105个/孔。待细胞基本长满时，用 20 μL 移液枪头垂直背面的直线划3条宽度一致的直线，直线间隔1 cm。PBS洗涤3次，去除划下的悬浮细胞，加入不含血清的培养基继续培养。分别在光学显微镜下观察0 h和24 h的细胞迁移情况，细胞迁移率（%）=（迁移距离/划痕距离）×100%。实验重复3次。

1.7 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力

将各组细胞置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，用不含胎牛血清的DMEM高糖培养基培养12 h。用50 μg/mL Matrigel（1∶8）稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，每孔约100 μL，每组设3个复孔，37℃下放置1 h。各组细胞消化后离心，细胞计数，调整细胞密度为 2×105个/mL，每孔加入细胞悬液200 μL（4×104个细胞），下室加入10%FBS培养基600 μL，37℃、5%CO2培养24 h。擦去上室面未穿过膜的细胞，4%多聚甲醛固定30 min，风干后用1%吉姆萨染色30 min，PBS涤洗3次，200倍倒置显微镜下记数膜下面5个不同视野的肿瘤细胞数，结果取平均值。实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若组间差异有统计学意义，进一步的两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒转染MDA-MB-231细胞的效率

在MOI=15条件下，用慢病毒转染MDA-MB-231细胞48 h后，绿色荧光蛋白表达率稳定增强，倒置显微镜下观察，荧光转染效率＞90%。见图1。

图1 慢病毒转染MDA-MB-231细胞48 h后的转染效率（×40）

2.2RSK4m1 mRNA在MDA-MB-231细胞中的表达

qRT-PCR检测结果（图2）显示，Con组、Mock组、OE组中RSK4m1 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.09、1.25±0.11、3.73±0.38，组间差异有统计学意义（F=126.879，P<0.001）；经两两比较，OE 组 RSK4m1的mRNA相对表达量高于Con组（P<0.001）和Mock组（P<0.001），Con组与Mock组比较，差异无统计学意义（P=0.246）。

图2 RSK4m1 mRNA在MDA-MB-231各组细胞中的表达

2.3 RSK4m1蛋白在MDA-MB-231细胞中的表达

Western Blot法检测结果（图3）显示，Con组、Mock组、OE组中RSK4m1蛋白的相对表达量分别为0.35±0.02、0.34±0.01、0.79±0.02，组间差异有统计学意义（F=937.122，P＜0.001）；经两两比较，OE 组RSK4m1蛋白相对表达量高于Con组（P＜0.001）和Mock组（P＜0.001），Con组与 Mock组比较，差异无统计学意义（P=0.908）。

图3 RSK4m1蛋白在MDA鄄MB鄄231各组细胞中的表达

2.4 过表达RSK4m1对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响

CCK-8法检测各组MDA-MB-231细胞在不同时间点相对应的OD值，结果显示，与Con组和Mock组相比，OE组除0 h未见明显差异（P=0.611）外，在24 h、48 h、72 h、96 h细胞的OD值均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。

图4 过表达RSK4m1对MDA鄄MB鄄231细胞增殖能力的影响

2.5 过表达RSK4m1对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力变化，结果显示，24 h后Con组、Mock组和OE组的细胞迁移率分别为（25.67±2.44）%、（24.47±2.25）%、（14.53±0.64）%，组间差异具有统计学意义（F=29.379，P=0.001）；经两两比较，OE组细胞迁移率明显低于Con组（P＜0.001）和Mock组（P=0.001），Con组与Mock组比较，差异无统计学意义（P=0.480）。见图5。

2.6 过表达RSK4m1对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响

Transwell小室检测各组细胞侵袭能力的变化，结果显示，Con组、Mock组和OE组细胞穿过Transwell小室膜的数量分别为（66.70±5.86）个、（58.67±4.16）个、（35.00±5.57）个，组间差异具有统计学意义（F=29.520，P=0.001）；经两两比较，OE组细胞穿过Transwell小室膜的数量明显低于Con组（P＜0.001）和Mock组（P=0.001），Con组与Mock组比较，差异无统计学意义（P=0.111）。见图6。

图5 过表达RSK4m1对MD A鄄MB鄄231细胞迁移能力的影响

图6 过表达RSK4m1对MDA鄄MB鄄231细胞侵袭能力的影响

3 讨论

p90核糖体S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase，RSK）是一组高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，可使40S核糖体亚单位S6蛋白发生磷酸化而促进某些mRNA翻译，在调节细胞生长和增殖过程中起重要作用［7-8］。RSK 家族包括 RSK1、RSK2、RSK3和RSK4［9］。本课题组前期研究发现，人乳腺癌组织中RSK4基因表达阳性率明显低于癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组织［10］。在过表达RSK4的乳腺癌细胞中，细胞的增殖和侵袭能力下降［11］。干扰RSK4基因在乳腺癌细胞株MCF-7的表达后，能明显促进裸鼠原位移植瘤生长及转移［12］。研究发现，RSK4可被MAPKs磷酸化激活，通过底物磷酸化抑制FGFR2-RASERK信号通路，进而调控细胞的生长、增殖和分化。以上研究表明，RSK4可能是重要的肿瘤抑制基因，并有抑制细胞生长、增殖及侵袭的能力。

可变剪接是真核细胞基因表达多样性的重要机制之一，同一个前体mRNA可剪接成不同的基因表达亚型。可变剪接在受体多样性、控制细胞生长发育等方面起着决定性作用，来源于单一基因的不同蛋白亚型，通过与其他蛋白结合可产生不同的亚细胞定位、酶催化活性等［13］。可变剪接可产生蛋白质异构体调节胚胎发育、细胞分化和凋亡等重要过程［6］。

Sun等［5］研究发现，RSK4除野生型外，由于第19外显子发生15个碱基的缺失突变（-15nt）和第21外显子的缺失突变（-E21），形成了三种变异体。该研究还发现RSK4对细胞生长、死亡和化学反应的影响取决于mRNA变体或表达的蛋白质异构体、细胞系的特异性及贴壁生长条件等。RSK4及其变异体常被发现在同一细胞内表达，但产生的作用可能部分相同，也有部分相反。本研究CCK-8实验表明过表达RSK4m1可显著抑制乳腺癌细胞的增殖能力；细胞划痕实验及Transwell小室侵袭实验分别提示过表达RSK4m1可显著抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力。从一定程度上验证了RSK4m1可能与RSK4有同样抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及转移的能力。有研究显示RSK4或RSK4m的相互作用蛋白参与tRNA代谢、氨基酸活化、蛋白折叠等多种细胞生理活动，且部分RSK4m相互作用蛋白还涉及肿瘤细胞的迁移、侵袭，如环化酶相关蛋白1（cyclase-associated protein 1，CAP1）、α-辅肌动蛋白 4（alpha-actinin 4，ACTN 4）等［14］。可变剪接引起转录组多样性的方法学已成为一种有效工具，不仅可用于改善肿瘤的生物学基础，还可用于寻找对诊断、治疗和预后更准确的分子标志物［15］。

综上所述，上调RSK4m1基因在乳腺癌细胞株MDA-MB-231的表达可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力，为RSK4m1可能作为乳腺癌治疗新靶点提供实验依据，但其具体作用机制仍需进一步研究。

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