miR-140-5p调控Nrf2影响结肠癌细胞5-FU耐药性

刘进生 黄良祥 李建党 吴健生 夏浩沄

miRNAs可能参与细胞发育、增殖、分化及肿瘤发生等多种生理病理过程［1-3］，被认为是结肠癌耐药的重要调节分子［4］。核因子NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）蛋白是一种亮氨酸拉链（leucine zipper，bZIP）蛋白，其高表达与肿瘤细胞耐药性有密切联系［5-8］。前期工作中，我们采用miRNA靶标预测数据库等预测并筛选以Nrf2为靶标的miRNA，认为miR-140-5p极可能靶向Nrf2而发挥其生物学功能。miR-140p-5p被报道与非小细胞肺癌、食管鳞癌等肿瘤发生发展密切相关［9-10］。本研究探讨miR-140-5p在结肠癌细胞5-FU耐药中的调控作用及Nrf2基因参与此过程的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞株SW480购于中国科学院上海细胞库。5-FU购于美国Sigmal公司；miR-140-5p的mimic、INH及其分别对照vector、NC均购于广州市锐博生物科技有限公司；兔抗Nrf2多克隆抗体、鼠抗β-actin多克隆抗体、二抗羊抗兔IgG、二抗兔抗鼠IgG购于美国Cell Signaling Technology公司；双荧光素酶报告分析试剂盒购于美国Promega公司。倒置显微镜系统购于德国Leica公司；7500Fast实时荧光定量PCR仪购于美国ABI公司；化学发光显影仪购于美国GE公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与结肠癌SW480/5-FU耐药细胞模型的构建 SW480/5-FU、SW480细胞培养于含10%FBS RPMI 1640完全培养基，置于37℃、5%CO2细胞培养箱。待细胞长至对数增长期，0.25%胰酶消化，重悬计数细胞，以0.8×105/mL细胞密度接种于96孔板中，待细胞长至汇合度为30%～40%时予不同浓度（1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、500 μmol/L、5 000 μmol/L、10 000 μmol/L）5-FU 干预 48 h，每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，采用酶标仪于450 nm处检测吸光度值。GraphPad软件计算IC50，并计算耐药指数（resistance index，RI），RI=IC50（SW480/SW480-5-FU）/IC50（SW480）。SW480/5-FU耐药细胞模型的构建方法参考文献［11］。

1.2.2 质粒构建 将WT-Nrf2-3'UTR片段和Mut-Nrf2-3'UTR片段克隆至荧光素酶报告载体（pGL4.22-luc2CP/Puro），合成WT-Nrf2-3'UTR荧光素酶报告质粒和Mut-Nrf2-3'UTR荧光素酶报告质粒。将WT-Nrf2片段和Mut-Nrf2片段克隆至pcDNA3.1质粒，构建WT-Nrf2质粒和Mut-Nrf2质粒。上述质粒均通过一代测序验证后进行大抽，用于后续实验。

1.2.3 细胞转染 SW480/5-FU、SW480细胞以4×105/mL细胞密度接种到6孔板，待细胞长至汇合度达70%～80%时转染。CCK-8、细胞集落形成实验检测细胞5-FU耐药性实验和qRT-PCR、Westernblot中，将SW480/5-FU细胞分为2组，分别转染25 pmol miR-140-5p mimic（mimic）和 25 pmol mimic 的模拟物 miR-140-5p vector（vector）；将SW480细胞分为2组，分别转染25 pmol miR-140-5p inhibitor（INH）和 25 pmol INH 的模拟物miR-140-5p NC（NC）。在荧光素酶报告基因检测实验中，将SW480/5-FU细胞分为4组，分别转染25pmol mimic+20 ng WT-Nrf2-3'UTR质粒、25 pmol vector+20 ng WT-Nrf2-3'UTR质粒、25 pmol mimic+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR质粒、25 pmol vector+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR质粒；将SW480细胞分为4组，分别转染25 pmol INH+20 ng WT-Nrf2-3'UTR质粒、25 pmol NC+20 ng WT-Nrf-3'UTR质粒、25 pmol INH+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR质粒、25 pmol NC+20 ng Mut-Nrf2-3'UTR质粒；以表达海肾荧光素酶的质粒作为内参照，转染48 h后检测。CCK-8和细胞集落形成实验检测Nrf2对miR-140-5p调控SW480/5-FU细胞5-FU敏感性实验中，将SW480/5-FU细胞分为4组，分别转染25 pmol mimic+20 ng WT-Nrf2质粒、25 pmol vector+20 ng WTNrf2质粒、25 pmol mimic+20 ng Mut-Nrf2质粒、25 pmol vector+20 ng Mut-Nrf2质粒；将SW480细胞分为4组，分别转染25 pmol INH+20 ng WT-Nrf2质粒、25 pmol NC+20 ng WT-Nrf2质粒、25 pmol INH+20 ng Mut-Nrf2质粒、25 pmol NC+20 ng Mut-Nrf2质粒；以表达海肾荧光素酶的质粒作为内参照。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力 细胞接种于96孔板干预后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，用酶标仪在450 nm波长处检测各孔吸光度值，并计算各组细胞活力。

1.2.5 细胞集落形成实验 将上述干预后的细胞消化，按照500个细胞/孔重新接种于12孔板中，置于细胞培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至肉眼看见集落，弃上清液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定细胞20 min，结晶紫染色液染色15 min，PBS清洗后拍照并观察集落形成情况。

1.2.6 qRT-PCR法检测相关基因的表达水平 将上述干预后的细胞裂解并抽提miRNA，抽提总RNA，紫外线分光光度仪测定RNA的浓度和纯度。miR-140-5p表达检测参考试剂盒说明说书进行操作，以U6作为内参，miR-140-5p的逆转录引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCATA-3'，上游引物序列：5'-GAGTGTCAGTGGTTTTACCCT-3'，下游引物序列：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；取 2 μg RNA 逆转录成 cDNA，按照每20 μL PCR反应体系中含有2 μg cDNA进行PCR反应，条件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循环 40次；72 ℃60 s。Nrf2表达检测：以GAPDH为内参，Nrf2上游引物序列：5'-CTTGGCCTGAGTGATTCTGAAGTG-3'，下游引物序列：5'-CCGAGATGGTGACAAGGGTTGTA-3'；取1 μg RNA逆转录成cDNA，PCR反应体系同上，条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环 40 次；72℃ 60 s。收集各孔循环阈值（Ct值）。所得的结果按照2-ΔΔCt相对定量法计算目的基因的相对表达量。每个样品设置3个复孔，3次实验取均值。

1.2.7 Western blot法检测相关蛋白的表达水平 裂解细胞，获取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取30 μg样品调整统一上样体积。用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品并转印至PVDF膜上，电泳条件：80 V 30 min，120 V 1.5 h；转膜条件：90 V 1.5 h。TBST（含吐温的Tris-HCL缓冲液）洗涤后5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，再次TBST洗涤；兔抗小鼠Nrf2多克隆抗体（1：1 000）4℃孵育过夜。TBST洗涤后用羊抗兔IgG二抗（1：1 000）室温孵育1 h，电化学发光显影液将膜孵匀，荧光成像系统进行化学发光成像，保存图片数据。

1.2.8 预测并筛选可能以Nrf2为靶标的miRNA 通过NCBI数据库搜寻Nrf2转录本3'UTR序列，采用miRNA靶标预测数据库 TargetScan（http：//www.targetscan.org/）、PicTar（http：//pictar.mdc-berlin.de/cgibin/PicTar_vertebrate.cgi）和 microRNA.org（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）预测Nrf2 3'UTR可能的miRNA和结合位点。通过PubMed检索上述数据库预测出的有关miRNA在肿瘤发生发展中的研究，确定本研究感兴趣的靶基因。

1.2.9 荧光素酶报告基因检测 参照说明书操作。裂解细胞20 min，移出10 μL于96孔荧光检测板内，加入35 μL LARII工作液迅速混匀，于多功能酶标仪中读取萤火虫萤光素酶激发荧光强度F值；取出检测板加入35 μL Stop&Glo工作液混匀，读取海肾萤光素酶激发荧光强度R值。根据公式计算相对荧光素酶活性：相对荧光酶活性=F值/R值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。多组数据间比较使用单因素方差分析，两组数据之间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480/5-FU耐药细胞模型的5-FU耐药性验证

细胞的5-FU耐药性验证结果显示，5-FU能明显抑制 SW480细胞活力，其 IC50为 45.8 μmol/L；与SW480相比，SW480/5-FU对5-FU的敏感性显著降低，在100 μmol/L浓度以内的5-FU干预下，SW480/5-FU细胞活力无明显影响，其IC50为499.3 μmol/L（图1）。基于上述结果计算，SW480/5-FU的耐药指数为 10.9（RI＞1.5），说明本实验所构建的 SW480/5-FU细胞模型具有较高的耐药性。

图1 CCK-8法检测5-FU对SW480细胞、SW480/5-FU细胞5-FU敏感性的影响

2.2 miR-140-5p在SW480细胞和SW480/5-FU细胞中的表达

qRT-PCR结果显示，SW480/5-FU细胞中miR-140-5p表达水平为SW480细胞的0.7倍（P＜0.05）。提示miR-140-5p表达水平可能与结肠癌5-FU耐药有关。

2.3 miR-140-5p调控SW480/5-FU细胞和SW480细胞对5-FU的敏感性

CCK-8检测结果显示，与转染miR-140-5p vector的对照组比较，转染miR-140-5p mimic可降低不同浓度5-FU干预48 h后SW480/5-FU的细胞活力，并明显抑制300 μmol/L 5-FU干预下SW480/5-FU细胞的增殖能力（图2A）。在SW480细胞中，与转染miR-140-5p NC的对照组相比，转染miR-140-5p INH能增加SW480细胞不同浓度5-FU干预48 h后的细胞活力（图2B）。此外，细胞集落实验结果发现，与转染miR-140-5p vector的对照组相比，转染miR-140-5p mimic能减少SW480/5-FU细胞的集落形成能力（P＜0.05）（图2C）。

图2 CCK-8法检测过表达miR-140-5p对SW480/5-FU细胞、SW480细胞5-FU敏感性的影响

2.4 miR-140-5p可直接结合并抑制Nrf2表达

通过对公共数据库进行挖掘，推测miR-140-5p能结合于Nrf2的3'UTR（WT-3'UTR）第347-354个碱基对，提示Nrf2可能是miR-140-5p的靶基因（图3A）。实验结果表明，在SW480/5-FU细胞中，与转染miR-140-5p vector的对照组比较，转染miR-140-5p mimic能显著抑制Nrf2的 mRNA及蛋白的表达（P＜0.05，图3B）；在SW480细胞中，与转染miR-140-5p NC的对照组相比，转染miR-140-5p INH能上调Nrf2 mRNA及蛋白的表达水平（P＜0.05，图3C）。进一步将Nrf2的3'UTR与miR-140-5p结合的位点设计突变（Mut-3'UTR），使其失去与miR-140-5p结合的能力（图3 A），并构建了带有野生型Nrf2 3'UTR的WT-Nrf2-3'UTR荧光素酶报告质粒（WT-Nrf-3'UTR质粒）和带有Nrf2 3'UTR突变的Mut-Nrf2-3'UTR荧光素酶报告质粒（Mut-Nrf-3'UTR质粒），用于荧光素酶报告基因检测。检测结果显示，在SW480/5-FU细胞中，与共转染miR-140-5p vector的对照组相比，共转染miR-140-5p mimic能显著下调WT-Nrf2-3'UTR的相对荧光素酶活性（P＜0.05），而对Mut-Nrf2-3'UTR的荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05，图 3D）；在 SW480细胞中，与共转染miR-140-5p NC的对照组相比，共转染miR-140-5p INH能显著下调WT-Nrf2-3'UTR的相对荧光素酶活性（P＜0.05），而对Mut-Nrf2-3'UTR的荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05，图3E）。以上结果共同说明，miR-140-5p可通过与Nrf2的3'UTR结合，下调Nrf2表达。

图3 miR-140-5p与Nrf2的关系

2.5 Nrf2参与miR-140-5p调控SW480/5-FU细胞对5-FU的敏感性

与共转染vector和WT-Nrf2相比，SW480/5-FU细胞共转染mimic和WT-Nrf2的细胞增殖能力明显下降（P＜0.05），提示 miR-140-5p能抑制 Nrf2过表达所导致的SW480/5-FU细胞对5-FU较强的耐药性（图4A）。细胞集落形成实验结果表明，过表达WT-Nrf2使SW480/5-FU细胞的集落形成能力明显增强，且能逆转miR-140-5p mimic干预下SW480-5FU细胞的5-FU敏感性（图4B）。

图4 miR-140-5p通过调控Nrf2影响SW480/5-FU细胞的5-FU敏感性

3 讨论

耐药一直是结直肠癌临床治疗面临的棘手问题，从miRNAs中寻求其耐药靶点成为目前结直肠癌耐药性研究的热点。我们前期研究通过公共数据库的数据挖掘，推测miR-140-5p可能与肿瘤耐药性相关基因Nrf2结合，可能参与肿瘤耐药调控机制。为进一步探究miR-140-5p在结肠癌耐药研究中的潜在价值，本研究通过构建人结肠癌细胞株SW480的5-FU稳定耐药细胞株SW480/5-FU，并验证了miR-140-5p在耐药细胞SW480/5-FU中高表达，提示miR-140-5p可能参与调控结肠癌5-FU耐药。本研究还发现miR-140-5p能显著增加耐药细胞株SW480/5-FU对5-FU的敏感性，提示miR-140-5p可能在抑制细胞对5-FU的耐药中有重要作用。

miR-140-5p已被证实与结直肠癌生长、侵袭及预后有关［12-14］。以往研究更多将Nrf2视为细胞氧化应激反应过程中的关键因子，可通过调控抗氧化相关蛋白，抑制损伤和炎症中氧化应激损伤发生［15］。近年研究发现，Nrf2基因激活可能促进新的癌变发生，且Nrf2能通过调节肿瘤微环境调控肿瘤对化疗药物的耐药性［5-6，15］。因此，抑制肿瘤细胞中 Nrf2的表达是克服肿瘤细胞耐药的重要策略。为进一步分析miR-140-5p对结肠癌细胞5-FU耐药性的调控是否与其结合Nrf2的互作作用有关，本研究首先通过双荧光素酶报告基因和Western blot实验进行验证，结果发现miR-140-5p可与Nrf2结合，并抑制耐药基因Nrf2表达；进一步探究miR-140-5p调控结肠癌细胞耐药性与miR-140-5p结合并抑制Nrf2之间的相关性，发现Nrf2可影响miR-140-5p对SW480/5-FU细胞的5-FU敏感性，即miR-140-5p能通过调控Nrf2表达影响SW480/5-FU细胞对5-FU的敏感性，进一步研究miR-140-5p靶向抑制Nrf2功能而在结肠癌细胞耐药性中的作用提供依据，有关方面值得深入探讨。

综上，本研究发现miR-140-5p可通过靶向抑制Nrf2表达而降低结肠癌细胞对5-FU的耐药性，为防治结直肠癌耐药提供了新方向，miR-140-5p有望成为逆转结直肠癌耐药的靶点。

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