清瘟败毒饮及其拆方组对ALI大鼠的干预作用

张旗，陈素娟，聂静，李强*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.福建医科大学药学院，福建 福州 350122)

清瘟败毒饮出自清代著名医家余师愚之《疫疹一得》，由生石膏、知母、甘草、黄连、黄芩、栀子、犀角(以水牛角代替)、生地黄、赤芍、牡丹皮、连翘、玄参、竹叶、桔梗共14味药组成，合白虎汤、黄连解毒汤和犀角地黄汤之意[1]。全方具有清热解毒、凉血泻火的功效，主治热毒充斥、气血两燔证，与ALI早、中期阶段的中医病机颇为吻合，故早期运用清瘟败毒饮能起到良好的治疗效果。在非典以及甲型 H1N1 流感合并呼吸窘迫综合征治疗中，临床证实清瘟败毒饮加减为有效药物，可与西药合用，作用显著[2-4]。张长志等组研究清瘟败毒饮对ALI大鼠炎症因子表达以及肺组织核因子-κB表达的影响。结果清瘟败毒饮可通过有效调节LPS致ALI大鼠血中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8、 IL-10和抗炎症细胞因子IL-13表达水平，促使炎症和抗炎症细胞因子趋于动态平衡，从而减轻肺部炎症细胞浸润，起到修复和保护损伤肺组织的作用[5]，但清瘟败毒饮对水肿抑制情况以及药效物质基础尚未阐明。

本课题已对清瘟败毒饮高、中、低剂量进行剂量考察，结果高、中剂量均能有效降低大鼠ALI损伤情况，且呈剂量依赖性[6]。然而，清瘟败毒饮干预ALI的药效物质基础尚未明确。由于清瘟败毒饮合白虎汤、黄连解毒汤、犀角地黄汤之意，由14味药组成，成分复杂，因此根据其功效对其进一步拆方分析，拆分为4个拆方组，分别为：清热泻火组(C1)、清热凉血组(C2)、清热燥湿组(C3)和其他组(C4)，为阐明其药效成分奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠70只，体质量200～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：NO.11400700130416。

1.2 试剂及主要仪器

大肠杆菌内毒素LPS(L2880，Sigma)；TNF-α试剂盒(Abcam)；牛血清白蛋白(A7030，pH-7，Sigma)；考马斯亮蓝G-250(code:0615，北京拜尔迪生物科技有限公司)；吉姆萨染液(北京博奥拓达科技有限公司)；MK3型酶标仪(赛默飞仪器有限公司)；德国Effendorf 5810R离心机；BX40F4型光学显微镜(OLYMPUS，日本)；AxioCam ERC5s成像系统(德国蔡司)；地塞米松磷酸钠注射液(天津金耀药业有限公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

2 清瘟败毒饮拆方组干预ALI作用

2.1 清瘟败毒饮拆方组的制备

清热泻火组(C1)：生石膏30 g，知母15 g，生栀子12 g，竹叶15 g。

清热凉血组(C2)：水牛角12 g，生地黄12 g，赤芍15 g，玄参15 g，牡丹皮12 g。

清热燥湿组(C3)：黄芩15 g，黄连4.5 g。

其他组(C4)：桔梗12 g，连翘15 g，甘草6 g。

10倍量水回流提取3次，每次1 h，过滤，滤液合并，减压浓缩即得拆方组的水提物，浓度分别为0.72 g/ml、0.68 g/ml、0.2 g/ml和0.33 g/ml。

2.2 ALI模型制备

将大鼠随机均分为7组，每组10只：空白组(Con)、模型组(LPS)、阳性组(地塞米松，DEX组)、清热泻火组(C1)、清热凉血组(C2)、清热燥湿组(C3)和其他组(C4)的大鼠颈部正中切口，暴露气管，除Con组外其余各组用1 mL 注射器经气管滴注LPS(5 mg/kg)溶液(生理盐水配制,10 mg/mL)，注入后迅速将动物直立并旋转，使药液能够均匀分布在肺中，待大鼠呼吸状态平稳后，再缝合伤口；Con组在同样的条件下，向气管内注入等体积的生理盐水。

2.3 给药方法

在造模前3天灌胃各拆方组的水提物，每日1次，阳性组 (DEX)于造模前1 h 给予地塞米松注射液(5 mg/kg)，Con组和LPS组灌胃给予治疗组等量的生理盐水，每日1次。7组动物均在造模12 h后取材。

2.4 指标检测

2.4.1 BALF中白细胞总数和多形核白细胞(PMNs)数

各组大鼠腹主动脉取血处死后，剪开颈、胸部皮肤，暴漏气管并进行气管插管。右肺结扎，左肺进行灌洗，用4℃ PBS 6 mL分3次进行灌洗(灌洗时保证每次打入2 ml、吸出1.5 ml的液体)，收集肺泡灌洗液(BALF)置冰上，离心(4℃，1 300 r/min，10 min)后收集上清液，-80℃保存。离心后的沉淀细胞重悬于PBS,白细胞总数以及PMNs采用血液分析仪进行检验。

2.4.2 BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和蛋白浓度的测定

取“2.4.1”项中离心后的肺泡灌洗上清液，采用考马斯亮蓝G-250法对各组大鼠BALF的上清液进行蛋白含量测定。用酶联免疫法测定TNF-α的含量，严格按照试剂盒说明书操作。

2.4.3 肺的湿/干比值(W/D)测定

大鼠麻醉后，取肺的右中叶进行称重(湿重)，将其置烘箱中, 60℃烘至恒重，记下干重，计算得出肺的湿/干比值(W/D)。

2.4.4 肺组织病理形态学观察

各组大鼠以腹主动脉取血处死后，取肺右下叶，10%中性福尔马林固定48 h，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肺形态学变化。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 清瘟败毒饮拆方组干预LPS诱导ALI大鼠BALF中PMNs浸润情况比较

实验结果显示,空白组的肺泡灌洗液中有极少的PMNs浸润；LPS组PMNs及白细胞总数均较Con组显著增加(P<0.01)；而C1、C2与C3组的PMNs及白细胞总数较LPS组显著降低(P<0.05)，且以C3组最佳(P<0.01)。白细胞总数和PMNs结果见表1，图1～2。

表1 清瘟败毒饮不同拆方组干预大鼠急性肺损伤的情况比较

注：与空白组(Con)比较，##P<0.01；与模型组(LPS)比较，*P<0.05，**P<0.01

图1 清瘟败毒饮拆方组干预ALI大鼠BALF中白细胞情况注：与空白组(Con)比较，## P<0.01；与模型组(LPS)比较，*P<0.05，**P<0.01

图2 清瘟败毒饮拆方组干预ALI大鼠BALF中PMNs情况注：与空白组(Con)比较，## P<0.01；与模型组(LPS)比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2 清瘟败毒饮各拆方组干预LPS诱导的ALI大鼠蛋白浓度和肺约湿/干比值情况比较

与空白组对比，模型组大鼠肺的湿/干比值显著增大(P<0.01);然而清瘟败毒饮4个拆方组能明显降低肺的湿/干比值(P<0.01)，尤其以C3组最为显著(图3)。与空白组比，模型组大鼠BALF中蛋白浓度显著增加(P<0.01)，然而C1、C2与C3组能明显降低肺泡灌洗液中蛋白浓度(P<0.05)，尤其以C2组最强(P<0.01)(图4)。结果见表1。

3.3 清瘟败毒饮拆方组干预LPS诱导的ALI大鼠TNF-α情况比较

与空白组对比，模型组大鼠BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)显著增多(P<0.01)；拆方组中C1、C2和C4TNF-α水平显著降低(P<0.01)，尤其以C1组最佳，结果见表1,图5。

图3 清瘟败毒饮拆方组干预ALI大鼠肺湿/干比情况注：与空白组(Con)比较，## P<0.01；与模型组(LPS)比较，**P<0.01

图4 清瘟败毒饮拆方组干预ALI大鼠的蛋白浓度变化注：与空白组(Con)比较，## P<0.01；与模型组(LPS)比较，*P<0.05，**P<0.01

图5 清瘟败毒饮拆方组干预ALI大鼠TNF-α变化注：与空白组(Con)比较，## P<0.01；与模型组(LPS)比较，**P<0.01

3.4 清瘟败毒饮拆方组改善LPS诱导的ALI大鼠肺组织病理形态变化情况

图6显示,光镜下空白组见肺泡结构完整，大小均匀，肺泡腔清晰、壁薄。模型组肺泡结构破坏，肺泡腔变窄，肺泡间隔明显增厚，肺间质及肺泡充血、水肿、大量炎性细胞浸润。拆方组能够使肺间质及肺泡充血、水肿程度降低、炎性细胞浸润减少。

图6 清瘟败毒饮拆方组干预ALI大鼠肺组织病理形态变化图(HE,200×)注：空白组(A)；模型组(B)；阳性组(C)；清热泻火组(D)；清热凉血组(E)；清热燥湿组(F)；其他组(G)

4 讨论

中医学认为,ALI患者多由外感时邪疫毒伤肺[7]，引起肺失宣降，水津不布，导致热毒痰癖互结而发病，病情加重时由肺累及全身，故可归于“温病”“瘟疫”范畴，这与现代医学内毒素血症所致ALI认识甚为相似[8]，本病初期多为热毒壅盛、肺失宣降，而肺不主气、水凌心肺是本病转危之关键[9]，因此多强调早期宜清热解毒为主，对抗机体“内毒”所产生的损害。

在非典时期，中医诊疗方案多强调早期治疗应清热解毒为主。根据临床运用情况，清瘟败毒饮加减是一种治疗临床疑诊或确诊SARS患者的有效药物，可以与西药合用，作用显著[3,10]。同时，中西医结合疗法在治疗甲型 H1N1 流感合并呼吸窘迫综合征中即运用清瘟败毒饮加减方剂，疗效满意，且对患者预后取得了理想疗效[4]。张伯礼[11]总结一线大夫的经验，总体上按卫气营血辨证，认为中医治疗方案的总原则是任何时期都要注重清热药的应用。邓铁涛[12]在病情极期(高峰期)用白虎加参汤、清营汤、犀角汤等，加用活血化瘀之品，效果显著。

实验结果显示，清瘟败毒饮拆方后的4个拆方组,清热泻火组、清热凉血组、清热燥湿组和其他组，各拆方组均能降低肺间质及肺泡充血、水肿程度以及炎性细胞的浸润；但相对比清热燥湿组和其他组，清热泻火和清热凉血组均能较好地改善大鼠ALI损伤(P<0.01)，本实验也证实清热法治疗ALI作用效果显著。

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