陕产细叶益母草中总生物碱的提取工艺研究

侯敏娜，何莉，郭飒

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

基金项目：2016年陕西省大学生创新创业训练计划项目(No.2961)

作者简介：侯敏娜(1981-)，女，硕士研究生，讲师，主要研究方向：中草药中活性物质研究。

收稿日期：2017-04-06

修回日期：2017-05-01

益母草(LeonurusjaponicusHoutt)是唇形科益母草属1年生或2年生草本植物，其药用部位多为益母草新鲜或干燥的地上部分，又称“莞蔚”。被历代医家誉为“血家圣药”“经产良药”，是治疗妇科疾病之要药。《本草纲目》云:“益母草行经养血，行血而不伤血，养血而不瘀血，诚为血家之圣药也。”活性成分主要有总生物碱，包括益母草碱和水苏碱等，具有活血调经、利尿消肿、抗炎镇痛等多种生理活性[1-5]。益母草作为一种传统的中药，临床应用广泛，但存在提取物中的活性成分含量低，药材及制剂有效成分差异显著。本次研究意在加快中药现代化进程，提高益母草资源利用效率，探索更先进的提取工艺，使益母草剂型多样化，充分利用益母草这一生物资源，现将研究情况报告如下。

1 材料

1.1 试剂及药材

益母草(自行收集于陕西延安，经我院生药教研室雷国莲教授鉴定为益母草正品)；雷氏铵盐(北京华科盛精细化工产品贸易有限公司)；95%乙醇(天津市河东区红岩试剂厂)；丙酮(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；盐酸(西安三浦化学试剂有限公司)；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器与设备

TU-1810紫外分光光度计(上海长城制造有限公司)；KQ5200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-2电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；FW100粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；RE-5299旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

2 方法

2.1 益母草中生物碱的含量测定方法

本实验采用雷氏盐比色法进行测定[6-7]。原理是利用雷氏盐在酸性介质中可与大部分生物碱生成难溶于水的络合物，将生物碱的硫氰酸铬铵盐沉淀溶于丙酮中,所得到的紫红色溶液在波长为510 nm处有最大吸收,可利用公式(1)。

W=A·M·V/ε

(1)

其中，M表示益母草中含量较多的水苏碱盐酸盐(C7H13NO2·HCl)，相对分子质量为179.63；ε表示硫氰酸铬铵在丙酮中的克分子吸收系数，为106.5；V表示溶解沉淀所取丙酮的毫升数，为10 ml；测其吸光度A,经计算可得到生物碱的含量W(mg)，得率Y可由公式(2)计算。

(2)

2.2 含量测定[8-11]

准确称取经干燥、粉碎、过80目筛的益母草粉10.0 g，加入一定浓度的适量0.5%盐酸乙醇溶液,进行超声提取，过滤,滤液水浴蒸干，加入0.1 mol/L HCl溶解,过滤,用等浓度的5 ml HCl洗涤,定容于25 ml容量瓶中。移取6 ml于锥形瓶中,加入0.1 mol/L HCl 6 ml,缓慢滴加新配制的2%雷氏铵盐溶液6 mL，置冰箱中过夜,抽滤,沉淀用10 ml冷水洗涤至溶液无色,抽干。沉淀加丙酮溶解并定容于10 ml容量瓶中,以丙酮为空白,在最大吸收波长为510 nm处测定吸光度,代入公式(1)、(2)中计算,可得到益母草中总生物碱的得率。

2.3 单因素考察

超声波辅助提取益母草中生物碱的影响因素主要包括超声时间、超声温度、超声功率、料液比、乙醇浓度、pH值等。本次研究考察超声时间、乙醇浓度和料液比这三个因素。

2.3.1 乙醇浓度对益母草中生物碱得率的影响

称取干燥、粉碎、过80目筛的益母草粉5份，每份10 g，置于250 ml锥形瓶中，依次加入200 ml浓度为50%、60%、70%、80%、90%的0.5%盐酸乙醇溶液，进行超声提取，超声功率为180 W，超声温度为40℃，超声时间为30 min。考察乙醇浓度对益母草生物碱得率的影响，实验结果见图1。

图1 乙醇浓度对益母草生物碱得率的影响

由图1可知，益母草生物碱的得率，随着乙醇浓度的增加，不断增大。当乙醇浓度大于70%时得率也在继续增加，但增加的幅度很小。所以，考虑到节省溶剂资源等原因，我们选取70%乙醇作为益母草生物碱乙醇提取的溶剂浓度。

2.3.2 料液比对益母草中生物碱得率的影响

称取干燥、粉碎、过80目筛的益母草粉5份，每份10 g，分别加入70%的0.5%盐酸乙醇溶液140 ml、160 ml、180 ml、200 ml、220 ml，进行超声提取，超声功率定为180 W，超声温度为40℃，超声时间为30 min。考察料液比对益母草生物碱得率的影响，实验结果见图2。

图2 料液比对益母草生物碱得率的影响

由图2可知，益母草生物碱得率随着料液比的增加呈不断增大趋势。当达到18 BV时得率也在继续增加，但增加的幅度很小。所以，综合考虑各方面原因，选取料液比为18 BV，作为益母草生物碱乙醇提取的溶剂用量。

2.3.3 超声时间对益母草中生物碱得率的影响

称取干燥、粉碎、过80目筛的益母草粉5份，每份10 g，分别加入70%的0.5%盐酸乙醇180 ml，进行超声提取，超声功率为180 W，超声温度为40℃，超声时间分别为30 min、35 min、40 min、45 min、50 min。考察超声时间对益母草生物碱得率的影响，实验结果见图3。

图3 超声时间对益母草生物碱得率的影响

由图3可知，在30～50 min内，随着时间的增加，得率也增加，但时间超过40 min后，随着时间继续增加，得率开始逐渐降低，表明益母草生物碱得率并不会随着时间的增加而无限增加，而在40 min时达到最高值。

2.4 响应曲面优化

2.4.1 响应曲面优选分析

在单因素的实验基础上，根据因素水平表1，按照响应曲面Box-Behnken的设计原理，共有17组实验，其实验结果如表1～2。

表1 因素水平表

表2 实验设计及实验结果

对该模型进行回归分析，结果见表3。

表3 方差分析表

注：*P<0.05显著;**P<0.01高度显著;***P<0.001极其显著

通过Design-Expert8.0.6软件对所得数据进行多元回归拟合，得到益母草生物碱得率对乙醇浓度(A)，提取时间(B)，料液比(C)的二次多元回归方程。

得率：

Y=-2.503 13+0.013 475A+0.047 775B+0.135 69C+2.500 0E-005AB-8.750 00E-005AC-1.500 00E-004BC-8.750 00E-005A2-5.800 00E-004B2-3.375 00E-003C2

对该模型数据，进行回归分析，结果见表3。由表3可知，模型P值(<0.000 1)及F值(119.70>0.05)，说明本次实验选用的二次多项式模型极为显著。同时失拟项F=0.317 7>0.05，表明失拟项不显著，可以对响应值进行预测，实验方案设计合理正确。

2.4.2 响应曲面分析与优化

根据实验结果，使用Design-Expert 8.0.6软件，绘制相应的响应曲面图及等高线图，见图4、图5、图6。

图4 乙醇浓度与超声时间的三维图和等高线

图4为乙醇浓度与超声时间对益母草中总生物碱得率的响应曲面图，由图4可以看出，当料液比一定时，益母草中总生物碱得率随着乙醇浓度增加呈增加趋势，但达到70%时，坡面增加的幅度较缓；超声时间不断延长，得率也在上升，但是在40 min后，呈下降趋势，且整个坡度比乙醇浓度的坡面要陡，说明得率受超声时间二次项的影响比乙醇浓度大。由图4可以确定最佳参数范围：乙醇浓度72%～76%，超声时间38～42 min。在此范围内益母草中总生物碱得率最大。

图5 乙醇浓度和料液比的三维图和等高线

图5为料液比和乙醇浓度对益母草中总生物碱得率的响应曲面图，由图5可以看出料液比的坡面比乙醇浓度的坡面陡，表明料液比的二次项对益母草中总生物碱得率具有明显影响，而乙醇浓度对其影响较小。由图5可以确定两因素最佳参数范围：乙醇浓度72%～76%，料液比为1∶17～1∶19。在此范围内的益母草中总生物碱得率最大。

图6 料液比与超声时间的三维图和等高线

图6为料液比与超声时间对益母草中总生物碱得率的响应曲面图，由图6可以看出料液比与超声时间的坡面都比较陡，说明他们的二次项对益母草中总生物碱得率的影响都比较显著，等高线趋于椭圆，说明超声时间与料液比的交互项对益母草中总生物碱得率的影响显著。由图6可以确定两因素的最佳参数范围：料液比1∶17～1∶19，超声时间38～42 min。

由此可知，优选的益母草中总生物碱提取工艺为：料液比为1∶18.25，提取时间为40.14 min，乙醇浓度为73.63%，在此条件下，益母草中总生物碱预测值为0.196 53%。综合考虑各方面因素，将实验参数修正为：料液比为1∶18，提取时间为40 min，乙醇浓度为74%，平行3次实验，经计算平均得率为0.195 27%，与理论值相差0.001 26%。因此，本方法确定的益母草中总生物碱提取工艺参数可靠，并且有一定的实际参考价值。

3 结论

通过单因素实验，运用响应曲面法，优化益母草中总生物碱的超声提取工艺参数，经综合考虑修正，最终优化条件为：料液比为1:18，提取时间为40 min，乙醇浓度为74%，此时益母草中总生物碱得率为0.195 27%。通过回归分析及验证实验，证明了该响应面法的合理性、可行性，可为益母草资源的开发及合理利用提供依据。

[1] 周本宏,马郁文,罗毅.超声提取益母草总碱的工艺优选[J].医药导报,2006,25(5): 451-452.

[2] ZHOU Ben-hong,MA Yu-wen,LUO Yi.Technology Optimizationfor U ltrasonic Ectraction of Total Alkaloids from Leonurus[J].Herald of Medicine,2006,25(5): 451-452．

[3] 李焕杰,孟祥云.不同溶剂及方法对益母草生物碱含量影响[J].陕西中医,2008,29(5):607-608.

[4] 徐冰,李宝泉,马勇.益母草有效成分的研究进展[J].天津药学,2003,15(3):68-70.

[5] 李万,蔡亚玲.益母草总生物碱的药理实验研究[J].华中科技大学学报(医学版),2002,31(2):168-170.

[6] 徐小华,杜绍亮,杨云.益母草中总生物碱的提取及含量测定[J].河南科学,2008,26(12):1481-1483.

[7] 李林.水苏碱的研究概况[J].安徽农业科学,2009,37(3):930-931.

[8] 严优芍.益母草质量标准、提取工艺和剂型的改进研究[D].广州:广州中医药大学,2005:19-23.

[9] 晁志,王厄舟,周秀佳.益母草药材中生物碱含量与产地生态环境的关系[J].第一军医大学学报,2000,20(6):504-506.

[10] 周文华,杨辉荣,岳庆磊.生物碱提取和分离方法的研究新进展[J].当代化工,2003,5(2):54-57.

[11] 喻朝阳,王晓琳.生物碱提取与纯化技术应用进展[J].化工进展,2006,25(3):259-261.