冬连三七组分调控AGEs/p38MAPK改善糖尿病动脉粥样硬化兔血管内皮损伤的机理研究

靳昭辉，高普，宋光熠，刘征堂，靳冰*，相田园

(1.中国中医科学院西苑医院，北京 100091;2.辽宁省基础医学研究所，辽宁 沈阳 110005)

糖尿病在社会疾病中占有越来越大的比例,至2035年,预计全球患糖尿病总人口将超过5.9亿[1]。糖尿病动脉粥样硬化(diabetic atherosclerosis,DA)是一种独立的糖尿病并发症,危害极大。血管内皮损伤是DA发生、发展的核心机制之一[2]。

高糖状态下，体内蛋白质与还原糖可以在非酶条件下发生反应形成稳定的共价化合物，即晚期糖基化产物(AGEs)，AGEs活化晚期糖基化产物受体(RAGE)，从而激活p38MAPK信号传导通路,引起级联反应，从而引起/促进血管内皮损伤[3]。

本课题所采用的中药组分冬连三七组分(麦冬多糖40%,黄连生物碱30%,三七总皂苷30%)是3味中药主要有效成分的组方,在前期研究中,已经使每味中药有效成分的提纯含量达到90%以上,经过反复测验优选配伍的比例,目前已是实验用药的最佳配伍方案。

我们在前期4项国家自然科学基金课题研究中发现[4-15],CONR能够调控降低DA大兔血糖相关指标，降低组织中AGEs、RAGE的含量，调整脂质代谢紊乱，有效减轻氧化应激反应造成的内皮细胞、血管及微血管、脏器组织的损伤。

本实验研究了CONR调控AGEs/p38MAPK信号转导通路对DA大兔血管内皮损伤的作用，并对其机理进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性纯种新西兰大白兔(辽宁长生生物技术有限公司提供，SCXK(辽)2010-0001),体质量(2.5±0.3)kg。实验前适应性喂养1周,单笼喂养,自由饮食,温度(22±2)℃,湿度(70±5)%。

1.2 药物

CONR(北京同仁堂药业公司)；辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司,批号140213)；四氧嘧啶(BDH Limited Poole England,5272460J)；SB203580(Calbiochem公司)。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 主要试剂

鼠抗兔p-p38MAPK抗体(Sigma);羊抗兔IgG、GAPDH羊抗兔、HPR(北京天德悦);SA 标准品(Sigma);蛋白抽提试剂,Millipore 2 mg/ml;BCA蛋白定量试剂盒(Pierce); 5×还原样品缓冲液、10×TBST pH值8.0、湿转缓冲液B、10×Tris-Glycine-SDS (赛诺博); NC膜,0.45 μm孔径( Millipore);考马斯亮蓝G-250(Appli Chem);中分子量预染蛋白Marker (Fermentas);Bis-Acrylamide、Tween-20、TEMED (Pierce);α-actinin、Trizma base、NP-40Glycine (Sigma);蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(Roche);丽春红染色液、Ponceau S、DTT、Stripping Buffer、Bromphenol Blue、PMSFAcrylamide、APS(AMRESCO)。

1.3.2 主要仪器

倒置相差显微镜;CO2培养箱;超净工作台;37℃恒温箱;超低温冰箱;酶标分析仪;优普超纯水机;激光共聚焦扫描显微镜;全自动生化分析仪、微量加样器;湿盒;凝胶成像系统;紫外/可见分光光度计;酶标仪;低温离心机(Thermo);MiniP-4、湿转电泳槽(Cavoy);酸度计PH211(Hanna);半干槽、电泳仪(伯乐生命);水平脱色摇床、电动组织匀浆仪(上海琪特)。

1.4 实验方法

1.4.1 DA大兔模型制备

雄性新西兰大白兔随机取10只作为空白组,其余50只兔耳缘静脉推注无菌生理盐水配制的5%四氧嘧啶(100 mg/(kg·bw))[16-17],6 h和12 h腹腔注射10%葡萄糖10 ml/只,72 h后测FBG,选取13.5 mmol/L≤FBG≤23.5 mmol/L作为模型兔。空白组喂食普通饲料30 g/(kg·d),每日分4餐喂养。模型兔喂高脂饲料(含2%胆固醇、0.5%胆酸和5%猪

油)30 g/(kg·d);1周后实验各组在40 mg/(kg·bw)戊巴比妥钠麻醉下球囊导管行腹主动脉内膜球囊损伤术[16，18],术后各实验组分别每日给予CONR 450 mg/kg、CONR 150 mg/kg、辛伐他汀3 mg/kg灌胃;SB203580 2 mg/kg腹腔注射[19],12 h重复给药。每日给予空白组生理盐水20 ml。10周后,于最后1次灌药/腹腔注射l h后(灌药/腹腔前禁食不禁水12 h),腹主动脉采血[20],无菌分离血清,经56℃,30 min灭活处理后,-20℃保存备用;取左心室组织备用。

1.4.2 ELISA法测定血清中AGEs、FBG、NO、ET含量严格按照说明书操作。

1.4.3 WesternBlotting 法测定各组p-p38MAPK蛋白含量

提取心肌细胞总蛋白,BCA法定量。-20℃保存。取70 μgDA兔的心肌细胞样品,进行凝胶电泳,转膜,摇匀(4℃,过夜),加入封闭液和适当的一抗,用TBST冲洗滤膜4次,10 min/次,加入二抗,室温孵育60 min,用TBST冲洗3次,每次10 min。PVDF膜上加入显影液,室温下停放1 min。用保鲜膜包装(尽量避免气泡)。 以α-肌动蛋白为内参，用ODYSSEY红外凝胶扫描系统定量分析各条带的总灰度值。

1.4.4 HE染色观察血管病理图

将固定好的标本乙醇脱水，石蜡包埋，制成4 μm石蜡切片，进行HE染色，在光镜下观测病理变化和主动脉血管病变情况。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 冬连三七组分对糖尿病动脉硬化兔空腹血糖的影响

结果见表1。CONR高、CONR低剂量组对FBG均有降低作用,显著低于模型组(P<0.01);而SB203580组、辛伐他汀组对DA兔的FBG无明显降低作用(P>0.05)。

表1 冬连三七组分对糖尿病兔空腹血糖FBG的影响

注：与模型组比较，*P<0.01;与空白组比较，△P<0.01

2.2 DA兔模型建立情况

分别选取并处死1只正常兔、2只模型兔,取胸主动脉。主动脉病变分布情况:空白对照组无病变,模型组胸主动脉内膜有许多黄白色或橙红色条纹凸起,病变严重,大部分主动脉有斑块覆盖。

2.3 ELISA法测定血清中AGEs、ET、NO含量

CONR高剂量组、CONR低剂量组、SB203580组对AGEs均有降低作用,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。CONR高CONR低剂量组、剂量组、SB203580组及辛伐他汀组对DA大兔的ET有降低作用(P<0.01);各实验组NO活性较模型组显著增强(P<0.01)。详见表2。

2.4 Western Blotting法测DA兔心肌细胞p-p38MAPK蛋白含量的表达

模型组较空白组心肌p-p38MAPK蛋白表达升高,有显著统计学差异(P<0.01)。各实验组较模型组对p-p38MAPK蛋白表达均有抑制作用(P<0.01)。CONR高剂量组、辛伐他汀组对p-p38MAPK蛋白的抑制作用优于SB203580组(P<0.01),CONR高剂量组和辛伐他汀组之间对p-p38MAPK蛋白的抑制作用无差异(P>0.05)。详见表2,图1。

表2 CONR对DA兔AGEs、NO、ET及p-p38MAPK蛋白的影响

注：与模型组比较，*P<0.01；与空白组比较，#P<0.01；与SB203580组比较，△P<0.01;蛋白质内参GAPDH。

图1 CONR对DA兔心肌细胞p-p38MAPK蛋白的表达注：A.空白对照组，B.模型对照组，C.CONR高剂量组，D.CONR低剂量组，E.SB203580组，F.辛伐他汀组

2.5 CONR对DA大兔主动脉病理的影响

模型组兔胸主动脉血管壁弥漫性隆起，突向管腔，内膜下有较多泡沫细胞、极少量纤维母细胞和胶原，中层平滑肌明显增生，并有炎细胞浸润;空白对照组兔胸主动脉动管壁三层结构清晰，内膜光滑完整，平滑肌排列整齐未见病理改变。药物干预各组在炎性细胞浸润，血管内皮损伤程度等方面明显减轻。结果见图2。

图2 CONR对DA大兔主动脉病理的影响(HE,400×)

3 讨论

3.1 糖尿病动脉粥样硬化血管内皮损伤机制

糖尿病动脉粥样硬化是其慢性并发症的基本病理改变之一。血管内皮损伤在糖尿病动脉粥样硬化发病过程中作用非常重要。

随着近年来研究的深入，许多研究表明糖尿病血管并发症与自由基介导的脂质过氧化有关，糖尿病动脉硬化的产生机制、发展过程和血管内皮损伤均有密切的关系，NO、ET能有效反映血管损伤水平[21]。

高血糖状态下，长期的代谢失衡产生大量的氧自由基(ROS)[22-23]，ROS可以通过AGEs等多种途径和直接作用引起血管内皮损伤[24-25]，导致血管病变并产生并发症。

本次研究结果显示，四氧嘧啶配合腹主动脉内膜球囊损伤术诱导雄性纯种新西兰大白兔的DA模型有着相对较高的ET，而NO水平相对较低，提示血管内皮细胞损伤增加;并且还发现DA兔主动脉内皮细胞肿胀，血管壁弥漫性隆起，凸向管腔，内膜下有较多泡沫细胞,极少量纤维母细胞和胶原，并有炎细胞浸润，主动脉内膜增厚，表明血管内皮损伤及持续高糖状态能促进DA的形成。

3.2 AGES/p38MAPK与糖尿病动脉粥样硬化血管内皮损伤

葡萄糖和蛋白质结合能形成AGEs,在高血糖条件下,蛋白质的非酶促糖化增加,最终导致不可逆的晚期AGEs生成增加。AGEs与特异受体RAGE结合,RAGE作为一个信号转导受体,可通过激活MAPK等信号通路[26],使活性氧基团产生增多从而参与血管内皮损伤[27-28]。

p38MAPK是MAPKs超家族成员之一,有研究发现[29],p38MAPK可导致和加速血管内皮损伤,是血管内皮损伤过程的重要调节蛋白,在糖尿病并发症的形成中起重要作用。

作为p38MAPK特异性抑制剂,SB203580能抑制p38MAPK通路及其后续的级联反应,发挥生物学效应[30]。模型组p-p38MAPK蛋白呈现高表达,CONR各组及SB203580组对p-p38MAPK蛋白体现出部分抑制作用,表明p38MAPK通路激活确实参与了DA兔血管内皮损伤过程。

3.3 中药配伍组分治疗DA的理论依据

中医学认为,DA的发病由多种因素参与,导致阴虚燥热兼有血瘀,这也是消渴病及其并发症的主要病机。依据这一理论,以滋阴清热、活血祛瘀为机理,结合现代研究进展,创建了冬连三七组分,由黄连生物碱、三七总皂苷、麦冬多糖组成。

黄连生物碱能促进葡萄糖酵解,胰岛β细胞功能恢复和再生,增强胰岛素敏感性，降低胰高血糖素水平[31],增加SOD活性,抑制p38MAPK,改善氧化应激反应[32]。麦冬多糖可以降低血糖、降低胰岛素的敏感性,可能与其有效改善氧化应激有关[33]。三七总皂苷具有抗氧化应激、影响自由基生成、改善微循环、增强免疫力等药理作用[34-36]。

冬连三七组分对糖尿病动脉粥样硬化兔模型具有防治作用。CONR可降低DA兔血糖水平,降低AGEs的过量产生,抑制p-p38MAPK蛋白高表达,降低其血清ET血管内皮损伤因子水平,升高血管内皮保护因子NO水平。进而提示,中药配伍组分可能部分通过调控AGEs/p38MAPK信号传导通路抑制血管内皮损伤进而控制DA的发生发展过程。

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