短时受精联合早期补救卵泡浆内单精子注射在非男性不孕治疗中的临床结局

徐玉婷 余照娟 李绪清 章志国 魏兆莲

在常规体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的过程中，受精失败时有发生，导致患者无胚胎可移植，被迫放弃本周期，给其带来巨大的精神负担和经济损失。目前研究[1-3]认为，采用短时受精联合早期补救卵泡浆内单精子注射(rescue intracytoplasmic sperm injection，rescue ICSI)的方法可提高受精率，降低周期取消率，改善临床妊娠结局。然而，与常规ICSI相比，早期补救ICSI的操作时间滞后约6 h，卵子在体外孵育时间延长，对后续胚胎发育和妊娠结局的影响报道不一[4-5]。目前，关于早期补救ICSI与下一周期直接ICSI的对比研究也缺乏相关数据。本文通过回顾性分析短时受精联合早期补救ICSI与相同不孕因素第1周期IVF/补救ICSI失败、第2周期行直接ICSI的临床资料，以同期因男方因素行ICSI的患者作为对照，以探讨早期补救ICSI的临床应用价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年1月至2017年1月在安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心行助孕治疗的患者，选择其中首次IVF卵子完全不受精，行早期补救ICSI的患者，共197例，为观察组A组(A组)；因第1周期行IVF或补救ICSI未妊娠、第2周期行直接ICSI的患者，共201例，为观察组B组(B组)。观察组均满足非男性不孕因素，即精液常规参数达WHO精液正常标准[6]。以同期因单纯男性不育因素行直接ICSI的患者，共408例，为对照组C组(C组)，C组直接ICSI的指征为[7]：精液常规分析为严重少精、弱精、畸形精子症，梗阻性无精子症(穿刺后有成熟精子)。

纳入标准：①女方年龄22～42岁，卵巢功能正常；②不孕年限≤15 年；③女方体质指数(body mass index，BMI)为18～25 kg/m2；④获卵总数≥5个，并排除获卵数过少对受精结局的影响。

排除标准：①夫妇双方任意一方染色体异常；②女方生殖道畸形、子宫内膜损伤；③不良妊娠史、复发性流产、不明原因不孕。

A、B 、C 3组患者在女方年龄、男方年龄、不孕年限、女方体质指数、促性腺激素(gonadotropin，Gn)用量、基础性激素水平[卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)和雌二醇(estrogen，E2)]、获卵数及成熟卵细胞数方面，差异无统计学意义 (P>0.05)，资料具有可比性。详见表1。

表1 3组患者一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案 依据患者年龄、BMI、基础性激素水平及促排卵过程中卵巢反应等情况，按照本中心常规，进行控制性促排卵方案。

1.2.1.1 长方案 患者自黄体中期，给予促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone-agonists，GnRH-a)，单次肌肉注射达菲林(3.75毫克/支，法国益普生生物技术公司)0.8～1.3 mg，或皮下注射达必佳(0.1毫克/支，瑞士辉凌国际制药有限公司)0.05 mg/d至人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)注射日；降调节14天后，达垂体降调节标准[8]：①子宫内膜厚度≤5 mm；②双侧卵巢窦卵泡直径≤10 mm；③FSH<5 U/L，LH<5 U/L，E2<183 pmol/L。肌肉注射Gn(可供选择的有果纳芬每支75 U，德国默克雪兰诺公司；贺美奇每支75 U，瑞士辉凌国际制药有限公司；丽申宝每支75 U，珠海市丽珠制药厂；普丽康每支100 U，美国默沙东制药有限公司)150～225 U/d促排卵，依据阴道超声监测的窦卵泡直径、血清性激素水平调整Gn用量，当至少有2个优势卵泡直径≥18 mm时，停用Gn；当晚肌肉注射hCG(每支5 000 U，珠海市丽珠制药厂)10 000 U或艾泽(250 毫克/支，德国默克雪兰诺公司)250 mg，36～38 h后，在超声引导下行经阴道穿刺取卵术，获得的卵母细胞置于受精培养液(Fertilization液，美国Cook公司)中。

1.2.1.2 超长方案 患者在月经周期第2日或第3日，肌肉注射达菲林3.75 mg，此后的第28日、第56日分别注射第2支、第3支，最后一支注射后的第 29～37天，检查垂体达降调节后，应用 Gn 150～225 U/d促排卵，其余同长方案。

1.2.1.3 短方案 患者于月经周期第1～3日开始皮下注射达必佳0.1 mg/d至hCG注射日，月经周期第3～5天加用Gn 150～225 U/d促排卵，其余同长方案。

1.2.1.4 拮抗剂方案 患者自月经周期的第2～3日开始肌肉注射Gn 150～225 U/d促排卵，当有1个优势卵泡直径≥14 mm或E2≥1 300 pmol/L时，开始皮下注射思则凯(0.25毫克/支，德国默克雪兰诺公司)0.25 mg/d至hCG注射日，其余同长方案。

1.2.1.5 微刺激方案 患者于月经周期第3日开始口服枸橼酸氯米芬胶囊(50毫克/片，上海衡山药业有限公司)100 mg/d，第5日加用尿促性腺素(每支75 U，烟台北方制药有限公司)150～225 U/d促排卵，至hCG注射日，其余同长方案。

1.2.2 精液准备 男方禁欲3～5 d后，在取卵日以手淫方式或手术穿刺取精，参照WHO标准[6]对精液进行常规分析和形态检测，采用密度梯度离心法或上游法处理精液。

1.2.3 受精情况 卵母细胞体外培养3 h后，B组和C组行ICSI显微注射，操作液为PVP(美国Sage公司)，A组加入精子密度为(5～10)×105/mL的精液，采用短时受精，精卵共孵育4～6 h后，拆除卵母细胞外的颗粒细胞，观察第二极体(the second polar body，2PB)的释放，所有成熟卵母细胞均无2PB时，为完全受精失败，即刻行补救ICSI。三组ICSI操作16～20 h后，观察受精情况，双原核(double protokaryon，2PN)双极体形成者为正常受精，正常受精卵转移至卵裂期培养液(cleavage液，美国Cook公司)中，置体积分数6%CO2、5%O2、37 ℃培养箱中培养。

1.2.4 胚胎质量评估 观察第3日(D3)胚胎发育，依据卵裂后的细胞数、细胞形态及碎片情况，评估卵裂期胚胎质量[9]。再将胚胎移入囊胚期培养液(blastocyst液，美国Cook公司)，继续培养到第5天(D5)或第6天(D6)，观察囊胚情况并分级，采用Gardner囊胚分级法[10]，D5：3AA、3AB、3BA、3BB；D6：4AA、4AB、4BA、4BB定义为优质囊胚。

1.2.5 胚胎移植或冷冻 考虑到补救ICSI新鲜周期移植会使胚胎发育与内膜生长不同步，故A组患者行全胚胎冷冻；B、C组依据患者的身体情况[11]并结合其意愿，行新鲜周期胚胎移植者，选择优质胚胎1～2枚，经阴道移植入子宫，剩余胚胎冷冻，未移植患者行全胚胎冷冻。所有胚胎经玻璃化冷冻保存于-196 ℃液氮中。

1.2.6 妊娠确认 冷冻胚胎者，根据排卵情况，选择自然周期或激素替代周期，行内膜准备，胚胎复苏后，选择优质胚胎的1～2枚，经阴道移植入子宫。新鲜或冷冻胚胎移植后第14天检测血中hCG浓度，若阴性，此次移植失败；阳性者为生化妊娠，于移植后第35天，行经阴道超声检查，见宫内孕囊诊断为临床妊娠。

1.2.7 观察指标 统计3组患者的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率及整个取卵周期的累计妊娠率。ICSI正常受精率=2PN数/成熟卵细胞数，卵裂率=2PN卵裂数/2PN数，优质胚胎率=来自2PN的优质胚胎数/2PN卵裂数；累计妊娠率=移植完一次取卵周期所有胚胎后妊娠的例数/移植完一次取卵周期所有胚胎的患者例数，其中同一患者纳入统计的妊娠例数上限为1。

2 结果

2.1 3组患者助孕结果比较 A、B、C 3组患者正常受精率、卵裂率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；优质胚胎率、累计妊娠率观察组两组患者低于对照组(P<0.05)，观察组A、B组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 3组患者助孕结果比较

注：*优质胚胎率A、B组比较：χ2=0.019，P=0.891；#周期累计妊娠率A、B组比较：χ2=0.001，P=0.981

3 讨 论

受精是一个复杂的程序化过程，主要包括精子穿过透明带、卵母细胞发生皮质反应、完成减数分裂、形成雌雄原核和启动卵裂[12]，受精过程中任一环节异常，都会造成受精失败。在常规IVF治疗过程中，平均受精率已超过70%，但仍有5%～10%发生完全受精失败[13]。男性方面：主要为精子功能低下、精子与卵子透明带结合异常或穿透障碍[14]，即使精液常规分析为正常，其精子的受精能力仍受到质疑，因为传统的精液常规无法评估中心体功能或精子顶体反应，因此不能准确预测受精结果。女性方面：卵母细胞透明带异常(包括透明带过厚、结构异常、表面缺乏精子受体)造成的精卵结合障碍[15]、卵母细胞成熟障碍或微观结构缺陷、颗粒细胞转录异常等。

Rawe等[16]研究发现，约55.5%的IVF受精失败是由于精卵结合障碍导致的，可通过施行ICSI来改善[17]。ICSI 技术是通过显微操作，将精子直接注射到卵母细胞胞质内，使精子避开透明带和卵细胞膜的屏障而发生受精。受精的标志是2PN形成和2PB释放，成熟的卵母细胞停留在第二次减数分裂中期(MII期)，当卵母细胞与精子结合受精，其被激活，完成减数分裂并释放出2PB。2003年，Chen等[18]首次将补救ICSI的时间从原来的加精子后16～20 h提前至6 h，有效地改善了受精率、胚胎质量和临床妊娠结局。文献[19-20]报道显示，IVF受精卵在受精后4 h有78.3%的卵母细胞释放2PB，6 h则达到92.9%。因此，可在IVF后6 h拆除卵母细胞外颗粒细胞观察2PB释放，及时发现受精失败，及早进行补救ICSI。本研究中，尽管观察组A组ICSI操作时间滞后B组6 h ，但在正常受精率、卵裂率、优质胚胎率及累计妊娠率上差异均无统计学意义(P>0.05)，这与戴蜜蜜等[21]的研究结果相似。上述结果表明把补救ICSI的操作时间控制在卵母细胞最佳受孕窗口10 h内，对受精和受精卵的发育潜能没有决定性的影响[22-24]。

本研究显示，观察组与对照组患者在正常受精率和卵裂率上差异无统计学意义(P>0.05)，而观察组的优质胚胎率、累计妊娠率低于对照组，这提示在非男性不孕因素患者中，卵母细胞本身质量缺陷是导致胚胎发育和妊娠结局欠佳的重要原因，ICSI操作尽管能够减少精卵结合障碍导致的受精失败，使异常卵母细胞受精并且卵裂，但不能挽救由卵母细胞质量缺陷引起的胚胎发育异常。而A、B组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，进一步说明了卵母细胞在受精前已存在微观结构的缺陷。传统的通过观察卵母细胞形态评价卵母细胞质量的方法存在很多缺陷，不能如实反映真实情况，因此，如何找到一个更准确、更利操作的卵母细胞评价体系将是今后工作的重点。

临床上，ICSI有着严格的适应证，早期补救ICSI，在避免周期取消的同时也带来遗传风险和子代安全性问题[25-26]。Huang等[27]发现，早期补救ICSI与常规IVF/ICSI分娩的新生儿相比，在性别、出生体重、出生缺陷上差异无统计学意义(P>0.05)；Chen等[28]也认为补救ICSI与常规ICSI患者在新生儿性别、出生体重、出生缺陷、围产期死亡率等方面相似。然而，早期补救ICSI的临床应用才刚起步，关于其子代的生长发育(身高体重、运动能力和智力水平等)，以及生殖功能等的评估，仍需长期的随访研究。

由于时间限制和失访率增加，本研究未能统计妊娠后的流产、分娩、新生儿出生参数等情况。如何改进现有的精液分析方法、选择较优的卵母细胞评价体系、找到准确预测受精失败的手段，是生殖医学工作者需要面对和亟待解决的问题。

综上所述，短时受精联合早期补救ICSI能够挽救受精失败，降低周期取消率，并与重复周期行ICSI有着相似的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率和累计妊娠率，值得临床推广。

[1] LIU W,LIU J,ZHANG X,et al.Short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI:an optimal strategy for complete fertilization failure after IVF[J].Hum Fertil (Camb),2014,17 (1):50-55.

[2] HUANG Z Y,LI J,LI W,et al.Brief co-incubation of sperm and oocytes for in vitro fertilization techniques[J].Cochrane Database Syst Revi,2013,4 (4):CD009391.

[3] JOHNSON L N,SASSON I E,SAMMEL M,et al.Does intracytoplasmic sperm injection improve the fertilization rate and decrease the total fertilization failure rate in couples with well-defined unexplained infertility?A systematic review and meta-analysis[J].Fertil Steril,2013,100(3):704-711.

[4] 陈智勤,潘家坪,滕晓明.比较短时受精联合早期补救ICSI与常规IVF在不明原因性不孕治疗的结局[J].生殖与避孕,2013,33(10):665-671.

[5] 罗平,罗江霞,杨冠群.早期补救卵胞浆内单精子注射在常规体外受精中的临床应用价值探讨[J].中国优生与遗传杂志,2017,25(6):118-120.

[6] WORLD HEALTH ORGANIZATION.Laboratory manual of the WHO for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction[J].Ann Ist Super Sanita, 2001,37(1):I-XII, 1-123.

[7] 陈振文,谷龙杰.精液常规参数与ICSI的指征[J].生殖医学杂志,2009,18(3):206-208.

[8] 刘思邈,邓成艳.垂体降调节后促性腺激素启动时机的选择[J].生殖医学杂志,2017,26(11):1092-1094.

[9] 黄国宁,孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术[M].北京:人民卫生出版社, 2012:95-115,163-175.

[10]GARDNER D K,LANE M,STEVENS J,et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome:towards a single blastocyst transfer[J].Fertil Steril, 2000,73(6):1155-1158.

[11]陈福才,邹薇薇,周燕君,等.新鲜周期单囊胚移植314例临床结局[J].中华生殖与避孕杂志,2017,37(1):10-15.

[12]陈大元.受精生物学:受精机制与生殖工程[M].北京：科学出版社，2000:166-171.

[13]周亮,王勇,王锦凤,等.短时授精对IVF受精正常患者治疗结局的影响[J].生殖与避孕,2015,35(3):196-200.

[14]刘德一,GORDON BAKER H W.精子功能检测与男性不育诊治的新进展[J].中华男科学杂志,2007,13(2):99-109．

[15]SWAIN J E,POOL T B.ART failure:oocyte contributions to unsuccessful fertilization[J].Hum Reprod Update,2008,14(5):431-446.

[16]RAWE V Y,OLMEDO S B,NODAR F N,et al.Cytoskeletal organization defects and abortive activation in human oocytes after IVF and ICSI failure[J].Mol Hum Reprod,2000,6(6):510-516.

[17]PALERMO G,JORIS H,DEVROEY P,et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte[J].Lancet,1992,340(8810):17-18.

[18]CHEN C,KATTERA S.Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF[J].Hum Reprod,2003,18(10):2118-2121.

[19]SUPPINYOPONG S,CHOAVARATANA R,KARAVAKUL C.Timing of second polar body extrusion and pronuclear formation after intracytoplasmic sperm injection [J].J Med Assoc Thai,2000,83(5):500-503.

[20]孙海翔.早期补救ICSI的安全性和应用价值[J].生殖医学杂志,2009,18(3):195-197.

[21]戴蜜蜜,葛红山,黄朝霞,等.常规IVF受精失败后行补救ICSI与直接ICSI的临床比较分析[J].实用医学杂志,2011,27(6):984-986.

[22]JACOBS M,STOLWIJK A M,WETZELS A M.The effect of insemination/injection time on the results of IVF and ICSI[J].Hum Reprod,2001,16(8):1708-1713.

[23]ANDREWS M M,FISHEL S B,ROWE P H,et al.Analysis of intracytoplasmic sperm injection procedures related to delayed insemination and ejaculated,epididymal and testicular spermatozoa[J].Reprod Biomed Online,2001,2(2):89-97.

[24]ISIKLAR A,MERCAN R,BALABAN B,et al.Impact of oocyte pre-incubation time on fertilization,embryo quality and pregnancy rate after intracytoplasmic sperm injection[J].Reprod Biomed Online,2004,8(6):682-686.

[25]DUMOULIN J M,COONEN E,BRAS M,et al.Embryo development and chromosomal anomalies after ICSI:effect of the injection procedure[J].Hum Reprod,2001,16(2):306-312.

[26]WEN J,JIANG J,DING C,et al.Birth defects in children conceived by in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection:a meta-analysis[J].Fertil Steril, 2012,97(6):1331-1337.

[27]HUANG B,QIAN K,LI Z,et al.Neonatal outcomes after ealy rescue intracytoplasmic sperm injection:an analysis of a 5-year period[J].Fertil Steril, 2015,103(6):1432-1437.

[28]CHEN L,XU Z,ZHANG N,et al.Neonatal outcome of early rescue ICSI and ICSI with ejaculated sperm[J].J Assist Reprod Genet,2014,31(7):823-828.