猪肉中赛庚啶残留检测提取方法探究

张 晶 福建省农产品质量安全检验检测中心 福州 350003

赛庚啶（二苯环庚啶，Cyproheptadine）为抗过敏药，主要用于治疗人的过敏性疾病。由于赛庚啶可在动物下丘脑食欲中枢对5-羟色胺拮抗，抑制下丘脑的饱觉中枢而刺激食欲、增加体重，因此，赛庚啶在动物养殖中非法使用后果较严重。2010年，农业部1519号公告将赛庚啶列入了《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》，制定了农业部标准《饲料中可乐定和赛庚啶的测定》[1]，并纳入全国饲料质量安全

监测工作中。统计近几年的监测结果，发现猪饲料阳性率比较高。赛庚啶具有中枢神经系统抑制作用，人服用后会出现嗜睡、镇静、头晕、反应力下降等毒副作用。 目前，已开展对动物组织[2]、猪尿[3]、饲料[4]等方法研究，尚无猪肉中赛庚啶残留检测方法的相关标准。本文探索对猪肉中赛庚啶残留物不同前处理提取方法比较，确定经酶解提取、离心净化后，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定猪肉中赛庚啶残留量，能有效排除干扰，而且该方法快速、简便、准确，可用于猪肉中赛庚啶残留量的测定。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器 超高效液相色谱串联质谱仪（Waters TQ-SUPLC/MS/MS）；瑞士梅特勒-托利多电子天平（AX105，感量 0.00 001 g）；奥豪斯电子天平（AR3130，感量0.001 g）；美国科俊高速冷冻离心机（D-37520）；美国 Organomation 氮吹仪（N-EVAP）。

1.2 对照品 盐酸赛庚啶对照品，含量100%，批号usp1161000，由BESTOWN公司提供。

1.3 试剂 甲醇、甲酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.4 赛庚啶贮备液的配制 精密称取盐酸赛庚啶对照品，用甲醇配制成含赛庚啶为1.0 mg/mL的标准贮备液。

1.5 赛庚啶对照品工作液的配制 精密量取适量赛庚啶贮备液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（30∶70）稀释成含赛庚啶为100 ng/mL的对照品工作液。

1.6 赛庚啶系列标准工作液的配制 精密量取适量赛庚啶对照品工作液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（30∶70）稀释成赛庚啶浓度为 0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 系列标准工作液。

2 仪器条件

2.1 液相色谱条件 色谱柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm），粒径：1.7 μm，柱温：30 ℃，进样量：1 μL，流速：0.3 mL/min；流动相A为 0.1%甲醇，B为0.1%甲酸水溶液。 梯度洗脱程序：0～4 min，30%～60%A；4～4.6 min，60%～90%A；4.6～4.8 min，90%～30%A；4.8～6.0 min，30%A。

2.2 质谱条件离子源模式 电喷雾正离子源模式（ESI+）；检测方式：多反应监测 （MRM）：源温：110℃；溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：1 000 L/h；毛细管气压：0.5 KV。定性离子对、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表1。

2.3 样品前处理方法的确定 猪肉组织预处理常用的方法有酸水解法、碱水解法、酶水解法、有机溶剂提取法等。

2.3.1 碱水解法 猪肉用0.1～2.5 mol/L氢氧化钠（钾）溶液中80℃水解30 min。碱水解法可使猪肉溶解，药物释放完全，但水解条件剧烈，适用于碱性条件下稳定的药物。

2.3.2 酸水解法 猪肉用0.1～0.6 mol/L盐酸溶液中45℃水解18 h。酸水解法条件比较温和，适用范围广，释放率较高。

2.3.3 有机溶剂提取法 用甲醇超声提取1～2 h。该法简便、适用范围广，但药物释放不完全且杂质多。

2.3.4 酶水解法 多采用葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶。酶水解法条件温和，不引起药物分解，是分析不稳定性化合物的首选方法，该法不足之处在于价格昂贵。

2.3.5 方法比较 对阳性猪肉样品进行水解效率比较试验，试验步骤如下。

2.3.5.1 碱水解法 称取猪肉2 g，加入5 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液，65℃水解4 h。

2.3.5.2 酸水解法 称取猪肉2 g，加入5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，65℃水解4 h。

2.3.5.3 酶水解法1 称取猪肉2 g，加入5 mL 0.2 mol/L乙酸铵溶液（pH5.2），65℃酶解 4 h。

2.3.5.4 酶水解法2 称取猪肉2 g，加入5 mL 0.2 mol/L乙酸铵溶液（pH5.2），37℃酶解 16 h。

试验结果表明，碱水解法提取效率最差；两种酶解法也同时做了不同酶解温度和酶解时间差别的比较，结果表明37℃酶解16 h的效率较高；酸水解虽然与酶水解的效果相当，但该方法提取效率较低，因此，最终选择37℃酶解16 h为猪肉水解方法。结果见图1。

图1 不同水解方法比较

2.4 样品提取、净化 取试样（2.0±0.05 g）于50 mL离心管中，加入乙酸铵缓冲液（称取15.4 g乙酸铵，溶解于1 000 mL水中，用适量乙酸调pH至 5.2）5 mL和β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL，混匀，37℃下避光水浴振荡16 h。加入盐酸溶液500 μL，混匀，再加入乙腈-0.1 mol/L的盐酸提取溶液5 mL，混匀，5 000 r/min离心5 min，取上清液，备用。混合型强阳离子交换柱MCX（Waters，60 mg，3 cc）依次用甲醇3 mL和水3 mL活化，备用液全部过柱，分别用水3 mL和甲醇3 mL淋洗，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱，洗脱液50℃氮气吹干，用乙腈-0.1%甲酸溶液0.5 mL溶解残余物，0.22 μm 滤膜过滤，待测。

表1 赛庚啶的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量参考值

3 结果与分析

3.1 线性关系的考察 赛庚啶对照品工作液适量，用乙腈-0.1%甲酸溶液（30∶70）稀释成赛庚啶浓度为0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL系列标准工作液，供超高效液相色谱-串联质谱法测定。线性结果为Y=0.316016X+0.000853419，相关系数r=0.999166，结果见图2。

图2 赛庚啶标准曲线线性图

3.2 添加回收与精密度 以空白猪肉作为测试对象，按2.4项下步骤，进行加标回收率试验，以考察方法的准确度和重现性。 配制 0.25 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg 和 10 μg/kg 四个浓度的试样，每批次内同一浓度做6次平行试验，共重复3批次。结果见表2、图3-图 4。

表2 批内回收率(n＝6)和批间回收率(n＝3)试验结果

4 讨 论

通过赛庚啶前处理方法的改进和优化，可增强样品中赛庚啶药物的提取效率，从而提高回收率和改善待测组分色谱峰形。用本方法检测猪肉组织中赛庚啶的残留，不但目标化合物与杂质分离效果好，而且准确度和灵敏度较高，是一种比较理想的分析方法，具有较强的可行性和实用性。

图3 赛庚啶标准品(1 μg/L)

图4 赛庚啶阳性添加样(0.25 μg/kg)

[1]中华人民共和国农业部.农业部1486号公告-2-2010饲料中可乐定和赛庚啶的测定 液相色谱-串联质谱法[S].北京：中国农业出版社,2010.

[2]李丹妮,严凤,周悦榕,等.QuEChERS-超高效液相色谱法-串联质谱法同时检测猪组织中赛庚啶及可乐定残留量[J].中国兽药杂志,2017,51(2)：29-34.

[3]曲斌,陆桂萍,蒋天梅,等.固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法快速测定猪尿中的赛庚啶 [J].中国兽药杂志,2013,47(1)：28-31.

[4]曹 莹,蒋 音,张文刚.高效液相色谱法分析饲料中的赛庚啶[J].中国饲料,2011(2)：39-40.