应用ELISA法检测HPRRS抗体的几个影响因素分析

吴 蔚 南平市动物疫病预防控制中心 福建南平 353000

ELISA法，即酶联免疫吸附法。由于其具有试剂产品稳定、操作相对简单、高灵敏性等优点，是目前我国应用于基层动物疫病抗体检测中的一种常用方法。在日常的免疫抗体效果监测中，人工操作不可避免，而影响ELISA检测结果的因素有很多，温育时间、温度、洗板次数等是其中的重要环节[1]。本文以检测高致病性猪蓝耳病抗体为例，就不同温育时间、温度、洗板次数，对比、分析可能引起ELISA试验数据不成立（即试验失败）的原因及影响。

1 材料与方法

1.1 样本与试剂 样本选取经过高致病性猪蓝耳病疫苗免疫后呈现不同抗体效价的猪血清12份。试剂为猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒（法国LSI）。

1.2 仪器 生化培养箱、微量移液器、酶标仪。

1.3 方法 将经过高致病性猪蓝耳病疫苗免疫后呈现不同抗体效价的猪血清12份进行编号 （1-12号）后分别做5个平行样。以样本1为例，取5个酶标反应板进行编号（板1-5），每份酶标板做12份样品，阴阳性对照做双份。酶标板1按照如下步骤操作：（1）按照试剂盒说明书将所有试剂回温至室温后混匀，配制洗液和样本稀释液。（2）对样本1-12用样本稀释液稀释后加入酶标板1的反应孔，阴阳性对照同时加入；盖膜，37℃温育60 min。（3）去膜洗板3次，拍干。（4）加酶标抗体。（5）盖膜，37℃温育 60 min。（6）去膜洗板 3 次，拍干。（7）加入底物溶液，轻摇后在20~25℃暗处作用10 min。（8）加入终止液，酶标仪（450 nm）读数最终换算成IRPC值。全部在酶标板的过程大致为：加样品－温育－洗板－加酶标抗体－温育－洗板－加底物－暗室作用－加终止液－读数。与酶标板1不同的是，酶标板2在温育阶段均改为37℃温育50 min，酶标板3在温育阶段均改为37℃温育90 min，其他操作相同；酶标板4在暗处时改为28℃作用10 min，其他操作同板1；与酶标板1唯一不同的是，酶标板5在洗板次数上增加2次。见表1-表3。

表1 时间因素试验条件设计

表2 温度因素试验条件设计

表3 洗板次数试验条件设计

2 结 果

各板试验结果见表4。与正常试验相比，在温育阶段缩短温育时间（如板2），试验失败（即阴阳性对照不成立，下同）；在暗处作用时，提高温度（如板4），试验失败。现阴阳性对照不成立的问题。即使对照成立，也可能影响到结果的准确性，如人医做HBsAg测定的室内质控中，就有出现弱阳性样本测成阴性的情况[2]；而酶标板在暗处作用时，若环境温度过高，如本次试验

表4 各板试验结果

对试验结果成立的板1、板3及板5进行方差分析 （SPSS 17.0）， 结果见表 5。 F=0.013，P （sig）=0.987＞0.05，无显著差异。

表5 板1、板3及板5的方差分析结果

3 讨 论

本试验是通过检测高致病性猪蓝耳病（HPRRS）抗体，探讨在酶联免疫吸附试验（ELISA）中各种因素对试验结果的影响。影响因素有很多，如血清的质量、试剂保存情况、人工操作等。人工操作环节因试验员不同，操作期间的影响因素较多，如温育的时间、温度、加样方式、洗板次数等。鉴于因素太多，本试验只选取了其中较为重要的、可能在操作过程中经常出现的几个因素来探讨。

从试验结果可见，温育时间不够或是周围环境温度过高都会导致试验失败。温育时间不够，试剂与样本在酶标板上就没有充足的反应时间，从而会出只增加3℃，试验也失败。日常兽医试验中我们常常会遇到需要适当延长温育时间的例子，如试验操作过程较长，而又恰巧在午餐时段；洗板时也会遇到个别试验员担心洗板不到位而人为增加洗板次数。通过对试验成立的板1、板3及板5的方差分析可以看到，适当增加温育时间及洗板次数对检测高致病性猪蓝耳病抗体效价影响并不大。

尽管有类似试验结果表明，由于特殊原因，可以适当增加温育时间及洗板次数[3-4]，但鉴于人工操作对试验结果的影响因素较多，我们还是建议在基层兽医试验操作过程中，合理把握时间，严格按照说明书操作，尽量避免以上因素对试验结果的影响。

[1]徐新蓉,龚国富,马萍.ELISA检测过程中影响因素及防控措施分析[J].国际检验医学杂志,2013,34(1)：112-113.

[2]徐锡霞,邓巍.温育条件对ELISA定性测定HBsAg结果的影响[J].实用肝脏病杂志,2005,8(1)：16-18.

[3]单以军.影响口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测实验结果因素的研究[J].畜牧兽医科技信息,2014(12)：21-23.

[4]帅敏,张玲,邓晓琴,等.延长实验温育时间对FAME全自动酶免分析结果的影响 [J].临床输血与检验,2008,10(1)：28-30.