微载体生物反应器按不同细胞密度培养猪圆环病毒2型的研究

2018-06-14江兴华崔龙萍张小兰陈丽萍阮鹭静福州大北农生物技术有限公司福州350014

福建畜牧兽医 2018年3期

江兴华崔龙萍张小兰陈丽萍阮鹭静福州大北农生物技术有限公司福州 350014

猪圆环病毒病是危害全球养猪业的重大经济影响性疾病，也是我国养猪业的三大疾病之一，与猪瘟和猪蓝耳病并称我国养猪业的三座大山[1]。猪圆环病毒2型（PCV2）可引发断乳后仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪繁殖障碍、母猪流产死亡综合征、育肥猪的慢性呼吸道病综合征和猪皮炎和肾病综合征等多种疾病,给养猪业带来很大的经济损失[2]。目前为止，疫苗免疫仍是控制PVC2感染引起相关疾病的重要手段，在疫苗的研制中，病毒抗原含量对免疫效果影响较大，由于PVC2在细胞中不产生细胞病变，体外增殖能力差，增殖滴度不高[3]。传统的生产猪圆环病毒的方法是使用转瓶细胞培养，随着细胞培养技术的发展，应用微载体生物反应器技术培养猪圆环病毒可大大提高抗原效价。

微载体系统细胞培养技术自1967年被用于动物细胞大规模培养,使动物细胞培养进入高密度培养阶段,经过几十年的发展,该技术已日渐完善和成熟,正逐渐取代转瓶的生产模式[4]，为了提高微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的抗原效价，本试验旨在对微载体生物反应器接种细胞时使用不同的接种密度培养猪圆环病毒2型进行研究，观察不同组的贴壁情况、不同时间的细胞状态、细胞增长情况，对比最终收获的抗原效价，从而选择微载体生物反应器的细胞最佳接种密度培养猪圆环病毒，提高抗原效价，提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 试验用微载体、干粉培养基微载体型号Cytodex1，购自美国GE公司；干粉培养基MEM购自Gibco公司。

1.2 试验用细胞与种毒 PK15细胞，PCV2种毒（DBN~SX07株）均由福州大北农生物技术有限公司提供，PCV2种毒效价为106.5TCID50/mL。

1.3 试验设备微载体生物反应器购自广州齐志工程设备有限公司；倒置显微镜购自上海光学仪器五厂；荧光显微镜购自日本尼康光学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微载体、生物反应器的准备、灭菌、无检称取4份10 g微载体，分别装在4个已硅化好的玻璃瓶中，各加600 mL PBS浸泡、过夜，然后弃去PBS，再加入新鲜PBS漂洗3次，最后一次留下适当体积的PBS，将4个装有漂洗过的微载体的玻璃瓶进行121℃、30 min高压灭菌，备用。准备4台相同型号的生物反应器与相应的瓶子与管道，分别校正4台生物反应器的pH电极与DO电极，然后组装好4台生物反应器及相应瓶子与管道，装上温度电极，进行气密性检验，合格后将组装好的生物反应器121℃、30 min高压灭菌。灭菌后将反应罐连接好，开启反应器，分别加入灭菌后的微载体各1瓶，然后加入500 mL细胞培养液进行预热培养，观察无菌情况，确保无菌后备用。

1.4.2 转瓶PK15细胞的消化取10瓶15 L瓶培养状态良好的单层PK15转瓶细胞，用PBS洗2次，加0.25%胰酶进行消化，消化中止后每瓶加400~500 mL营养液，然后将细胞瓶用力旋转摇甩，然后将10瓶消化后的细胞混合成一个转瓶并摇匀，细胞摇匀后取少量细胞样进行细胞计数。

1.4.3 接种前细胞计数将转瓶消化下来的细胞用细胞培养液按4~5倍的稀释倍数进行稀释，将稀释后的细胞液加入细胞计数板中，在显微镜下进行计数，并根据细胞计数结果与稀释倍数，换算转瓶消化后的细胞密度。

1.4.4 细胞接种上罐分别将4台生物反应器进行编号，分别编为 A、B、C、D，四组生物反应器细胞接种密度分别按每个微载体20、30、40、50个细胞，并计算出每组反应器所需的细胞总数，将消化后的细胞根据细胞密度与不同组反应器所需的细胞总数，计算出每组反应器所需要的细胞体积，每克微载体的数量为4.3×106个，然后根据每组反应器需要的细胞体积，将转瓶消化后混合的细胞分装成相应的4瓶细胞，然后将4瓶细胞均加入60 mL种毒（接毒量为培养体积的3%），加入反应器罐中，用营养液补足至2 L。

1.4.5 细胞上罐后培养与取样观察细胞上罐后设置好培养参数，如pH、DO、温度、搅拌器转数，开启培养，细胞培养至4 h分别进行取样，在显微镜下观察细胞的贴壁情况与细胞状态。培养至24 h弃去每罐的培养液，重新加入新鲜的含2%血清的维持液继续培养，分别在24 h换液前、培养48 h、培养72 h时进行取样留样，在显微镜下观察不同时间细胞的生长情况与细胞状态，并进行细胞计数。

1.4.6 微载体上的细胞计数分别从4组留样中各取1 mL含微载体的样至1.5 mL的EP管中，静置，等微载体沉淀后将上清液吸出，加入1 mL结晶紫，摇匀后置37℃培养箱中，30 min后充分震摇，培养至60 min时取出，充分震摇，然后按适当稀释倍数进行稀释，将稀释后的样吸出少量加至细胞计数板中进行计数。

1.4.7 抗原收获与留样当细胞培养至72 h，每6 h观察一次反应器PID曲线，并取样观察细胞脱落情况，当细胞脱落达70%时，将反应器的转数提高至150 r/min，搅拌5 min，然后静置3 min，通过管道收取反应器内的上清液，将每组反应器收获的抗原分别取2 mL样用于检测抗原效价。

1.4.8 抗原效价的检测用间接免疫荧光法测定病毒效价，将4组反应器培养的抗原样品，分别用刚消化好的测毒用细胞悬液进行10倍系列稀释，每组均取10-4、10-5、10-6三个稀释度稀释后的病毒细胞液，分别加入96孔细胞培养板中，每个稀释度加6孔，100 μL/孔，同时设立阳性对照与阴性对照。培养24 h后换含3 mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养48 h。培养至48 h时进行细胞固定、加一抗与二抗孵育，然后在荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无荧光物质着染，而有绿色荧光物质着染的细胞孔判为PCV2感染阳性。统计各组每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50，即抗原效价。

2 结果与分析

2.1 细胞贴壁4 h后的贴壁率与细胞状态从表1数据可知，B组与C组按每个微载体30、40个细胞量上罐的细胞贴壁率较高，而且细胞状态较好，贴壁率可达90%以上，而A组与D组按每个微载体20、50个细胞量上罐的细胞贴壁率较低，同时细胞状态也较差。

表1 各组反应器4 h的贴壁率与细胞状态

2.2 各组反应器细胞培养24 h、48 h、72 h的细胞状态与细胞增长情况从表2数据可知，四组反应器培养至24~48 h的细胞状态较好，至72 h后细胞状态开始变差，同时四组反应器细胞在贴壁后开始增长，24 h增长倍数不高，培养48 h后增长倍数最高，72 h后细胞增长倍数开始下降，各时间段整体细胞状态最好的是B组与C组，A组与D组的细胞状态相对较差，在四组中各时间段细胞增长倍数最高的是C组，其次是B组，增长倍数最低的是A组。

2.3 收获时间与最终抗原效价情况从表3数据可知，C组收获时的培养时间最长，达112 h，同时收获的抗原效价也最高，达到107.5TCID50/mL，其次是B组，A组与D组收获时的培养时间相对较短，同时收获的抗原效价也相对较低，A组的效价最低，只达106.5TCID50/mL。

表3 不同组反应器的收获时间与最终抗原效价

3 讨论

1）生物反应器微载体培养技术具有如下优点：微载体的表面积与体积比增大，可在有限的空间里提供大量表面积，从而获得密度较高的基质细胞；另外，采用该培养技术可自动化监控细胞的生长情况，有效减少人力、物力、财力，能够降低污染，尤其适合大规模批量生产[5]。由于生物反应器培养相对转瓶培养具有较大的优势，所以，近几年越来越多的疫苗企业开始研究生物反应器培养病毒工艺并应用于大生产，生物反应器培养病毒是生物制品行业未来的发展趋势。

2）影响生物反应器生产的抗原效价因素很多，如细胞接种密度、接毒量、培养液pH、溶氧、温度、收获时间等，本课题组在转瓶培养中发现细胞密度是影响抗原效价的一个重要因素，本试验针对生物反应器的细胞接种密度进行了研究。

3）许多研究表明，细胞生长的最终密度分别与细胞的接种密度和微载体浓度有关[6]。本试验表明细胞接种密度太低，细胞贴壁不均，贴壁率低，细胞增殖缓慢，生产的抗原效价低；细胞接种密度过大，同样造成细胞贴壁不均，细胞增长不高，生产的抗原效价不高。章孟学等[7]研究也表明，细胞密度过大，可能会造成病毒吸附不均匀，导致病毒复制不均。

4）疫苗的抗原效价是决定成品免疫效果的一项重要因素，要提高疫苗免疫效果，提高产品销量，打造产品的品牌，可利用生物反应器来培养病毒，优化反应器培养工艺来提高抗原的效价，提高免疫效果。

影响抗原效价的因素很多，本试验研究了反应器细胞的接种密度，对于反应器的接毒量、溶氧等其他因素还有待进一步研究。