腹泻幼犬粪便中沙门氏菌的分离与鉴定

凌清标 福建省莆田市秀屿区笏石畜牧兽医站 福建莆田 351146

沙门氏菌（Salmonella）属于革兰氏阴性杆菌，是一种重要的人兽共患致病菌，其主要在人和动物的肠道内寄生。自1885年首次从患畜体内分离到猪霍乱沙门氏菌至今，全世界范围内沙门氏菌血清型已经达到2 500多种，部分血清型可以引起严重的沙门氏菌病，甚至造成死亡[1]。全世界人沙门氏菌感染有逐渐上升的趋势，由沙门氏菌引起的细菌性疾病也在增加，对畜牧业发展、人类健康造成严重危害，因此，控制沙门氏菌的传播对于食品安全和兽医公共卫生有着重要的意义。随着人民生活水平的提高，宠物饲养越来越多，其作为人兽共患病的传染源给宠物饲养者和社会公共健康造成严重的威胁。该研究从一例诊断为细菌性腹泻幼犬病例的粪便中进行细菌分离，得到一株疑似沙门氏菌，并且进行分子生物学鉴定和药敏试验。

1 材料和方法

1.1 样品采集 用棉拭子无菌采集腹泻幼犬的直肠拭子。

1.2 主要试剂 TSA、HE琼脂、BS琼脂、革兰氏染色液均购自青岛海博生物科技有限公司；2×PCR Mixture、DL2000 DNA Marker购自TAKARA公司。

1.3 细菌分离 采集的拭子直接涂抹TSA平板、HE琼脂平板、BS琼脂平板，置37℃培养16~24 h，无菌挑取10~12个单菌落进行革兰氏染色，并对染色形态一致的菌落在新鲜的TSA平板划线纯培养。

1.4 沙门氏菌PCR鉴定 细菌DNA的提取[2]：采用热裂解法提取DNA，挑纯培养物单菌落在EP管重悬于100 μL蒸馏水中，煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清为DNA模板，置-20℃冰箱保存、备用。

PCR扩增：参照2013年查华等报道的沙门氏菌肠毒素基因stn引物序列[3]，由福州尚亚生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 沙门氏菌基因引物序列

PCR反应体系与反应条件：反应体系见表2。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统下观察结果。

表2 PCR反应体系

1.5 药敏试验 药敏纸片购自杭州天和微生物有限公司，包括头孢噻肟、氨苄西林、氯霉素、庆大霉素、四环素、卡那霉素、环丙沙星、氟苯尼考、多西环素，试验方案按照CLSI标准进行。

2 结 果

2.1 细菌菌落形态 经过37℃培养，在TSA平板上长出形态均一的菌落，在HE平板上长出蓝绿色、中心呈现黑色的菌落[1]，而在BS平板上呈现棕褐色、有金属光泽、周围培养基呈棕色的菌落[1]（见图1），挑取单菌落经革兰氏染色、镜检，均为革兰氏阴性肠杆菌，疑似为沙门氏菌。

图1 分离菌在HE培养基（左）和BS培养基（右）上生长状态

2.2 疑似菌PCR鉴定 采用沙门氏菌肠毒素基因stn的特异性引物，对挑取的疑似菌落进行PCR检测，挑取的单菌落均为阳性（见图2）。因此，该次从腹泻幼犬粪便中分离到的病原可确定为沙门氏菌。

图2 可疑菌的PCR鉴定

2.3 沙门氏菌药敏试验 按照CLSI标准进行判定，分离到的沙门氏菌对头孢噻肟、环丙沙星、氟苯尼考敏感，对氨苄西林中等耐药，对氯霉素、庆大霉素、四环素、卡那霉素、多西环素耐药。

3 讨 论

本研究从腹泻幼犬粪便中进行病原分离，经鉴定为沙门氏菌，并对该株沙门氏菌进行了初步的药敏试验分析，仅对头孢噻肟、环丙沙星、氟苯尼考敏感，与当时使用头孢噻肟治疗的效果一致。而分离菌株对多数抗生素具有耐药性，提示宠物饲养人员需要提高警惕，防止沙门氏菌对家庭成员生活环境和周围环境造成污染引发公共卫生健康问题。因此，要加强宠物管理，提高宠物饲养人员的卫生健康意识，防止人兽共患病从宠物向人传播而造成人的感染和发病。

[1]陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京：中国农业出版社,2007.

[2]王军.亚抑菌浓度抗生素对猪源耐药沙门氏菌生物膜形成的影响[D].武汉：华中农业大学,2012.

[3]查华,石火英,吉贞颖,等.2010-2012年苏皖两省鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国家禽,2013,35(4)：17-20.