一株细菌对芴的降解

胡 红，雒晓芳，龙子扬，熊 梅，唐阳国，王福彬

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州 730030)

多环芳烃化合物(PolycyclicAromaticHydrocarbons，PAHs)是烃源岩、原油、煤以及现代沉积物中含量仅次于饱和烃的重有机族组分，它由很多化合物组成[1].芴(Fluorene)属于一种多环芳烃，常存在于石油、煤焦油及烟草等物质中.这些物质燃烧或者处理不彻底就会将芴排入环境，如烟草燃烧、燃煤、汽车排气[2]，在地表水以及土壤中也能检出芴[3-5].在石油中，芴的含量表现出较高比重[1]，因此在石油污染的地方芴含量也较高.

芴对眼睛、皮肤及呼吸道会产生剌激，食入后可引起恶心、呕吐及腹泻[6]，对人体健康及生态环境具有一定的风险，是一种值得引起重视的环境污染物，因此对芴进行降解也应予以重视.

土壤微生物是土壤生态系统比较活跃的组分，在维持土壤生态系统的稳定以及受损生态系统的恢复与重建过程中发挥重要作用[7].有些土壤微生物类群能通过基因表达的蛋白酶，或通过共代谢作用降解有机污染物[8].有的类群形成了以某些污染物作为惟一碳源或能源的生理代谢特征.向林[9]等人对水中芴的微生物降解途径进行研究并取得较明显的成果.

由陕西济源油田附近被石油污染的土壤中分离纯化得到的X2菌株，用于芴的降解效果，具有科学性及实践性.本实验首次以X2菌株对芴进行降解，以探究该菌对生物环境治理的意义，为进一步发现新的石油污染治理提供思路.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种分离材料

该菌株来源于西北民族大学实验中心形态实验室，由陕西济源油田附近土壤中分离获得，初步命名为X2.

1.1.2 培养基

1) 种子培养基：营养琼脂培养基，蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂12 g/L.

2) 发酵培养基：营养肉汤培养基，蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉3 g/L，NaCl 5 g/L.

1.1.3 试剂

盐酸(AR)；浓硫酸(AR)；氢氧化钠(AR)；芴(AR)；环己烷(AR)；活性炭(AR)等.

1.1.4 仪器

DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，Q/BKYY22-2001型净化工作台(上海跃进医疗器械厂)，TDL-50B台式离心机，HH-B11-600-BS-Ⅱ型电热培养箱，BCD-235型Haier冰箱(青岛海尔股份有限公司)，气流烘干箱，FA2204N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，Mb型数显恒温电热板，DHG-9140A型 新型电热恒温鼓风干燥箱，ZWY-200D恒温培养振荡器，HVE-50高压灭菌锅Hirayama manufacturing corporation made in Japan，UV-2300紫外分光光度计，双光束紫外可见分光光度计以及常见的玻璃仪器.

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

取4 ℃冰箱保存的X2菌株接种于种子培养基中活化，然后再接种于发酵培养基中扩大，经28 ℃恒温振荡72 h[10，11]，然后放置4 ℃冰箱保存待用.全程应采取无菌操作技术，防止其他杂菌污染.

1.2.2 菌株对各物质在不同条件下的降解1.2.2.1 不同温度下的降解率

将5 mL(菌浓度为0.80～1.41×108个/mL)的菌液分别加入处理好的含有0.3 g芴的三角瓶中，设置温度单因素分别为25 ℃、27 ℃、30 ℃、34 ℃.分别在设置的温度下，于恒温振荡箱中培养72 h后，测定培养物的吸光度，记录、制图并且计算[12].

1.2.2.2 不同pH值下的降解率

用0.5 mol/L的盐酸和0.5 mol/L氢氧化钠溶液调节5 mL(菌浓度为0.80～1.41×108个/mL)菌液的pH值.设置pH值单因素分别为6.0、7.0、8.0、9.0[2]，然后加入到含0.3 g芴的三角瓶中，在恒温振荡箱中培养72 h后，测定培养物的吸光度，记录、制图并且计算.

1.2.2.3 不同芴的质量下的降解率

将5 mL(菌浓度为0.80～1.41×108个/mL)的菌液加入处理好的含有芴的三角瓶中，设置芴的质量单因素分别为0.3 g，0.6 g，0.9 g，1.2 g，在恒温振荡箱中培养72 h后，测定培养物的吸光度，记录、制图并且计算.

1.2.2.4 不同鼠李糖脂浓度下的降解率

将5 mL(菌浓度为0.80～1.41×108个/mL)菌液加入到含有0.3g芴的三角瓶中，设置鼠李糖脂浓度单因素为100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、500 mg/L，在恒温振荡箱中培养72 h后，测定培养物的吸光度，记录、制图并且计算.

1.2.3 多因素交互试验

利用Design-Expert8.0.6软件中Box-BehnkenDesign模型，将单因素试验结果用来设计多因素交互方案，并按照所设计方案进行模型试验及验证试验，因素水平编码表如表1所示.

表1芴降解响应面试验因素及水平

2 结果

2.1 不同芴质量降解率的影响

芴的质量对降解率的影响结果见图1.

图1 不同质量梯度下芴的降解率

由图1可以看出，芴的降解率在0.3～1.2 g之间，降解率先缓慢增大后再大幅减小，在0.6 g时降解率达到最大.在0.6 g以前降解率维持在较高水平，起伏较小，都在80%以上.可见芴的质量较小时更适合X2的降解作用；而质量在0.6 g后，曲线走势陡峭呈明显下降趋势，降解率也随之下降.降解率最大达82.2%，最低至45.2%，降解率极差达37.0%.可见芴的质量对其降解率有较大影响.

2.2 温度对各物质降解率的影响

温度对芴降解率的影响结果见图2.

图2 不同温度下芴的降解率

由图2可以看出，不同温度对芴的降解影响有着较为明显的差异，曲线呈明显的“抛物线”形状，降解率起伏较为明显.温度在25～34 ℃间，芴的降解率先增加后减小，28 ℃左右时到达峰值.25～28 ℃时降解率增大较快，在28～30 ℃之间降解率都维持在70%左右.28～34 ℃区间内降解率呈下降趋势，但走势较为平缓.降解率最大达73.6%，最低至47.9%，极差达25.7%.可见该菌不耐热，即菌株处于该温度条件时生长最旺盛，与诸多文献描述该菌的最适生长温度一致[11，12].

2.3 pH值对各物质降解率的影响

pH值对芴降解率的影响结果见图3.

图3 不同pH值条件下芴的降解率

由图3可以看出，pH值对各芴的降解效果有较大差异.在pH值为6～9之间时芴降解率先快速增大后缓慢减小，到7左右时降解率达到最大.在6～7之间时降解率上升较快，从32.3%增加到53.0%，极差达20.7%.而pH值为7～9之间时下降十分缓慢，基本上维持在一个稳定水平.可见对芴的降解在偏中碱性时更高，或者说更适合菌的生长.在酸性环境下该菌的生长、酶的活性受到抑制，从而使芴降解更困难，说明该菌不耐酸[11，12].整体上pH对芴的降解影响较大，最大降解率只能到达50%左右.

2.4 鼠李糖脂浓度对各物质降解率的影响

鼠李糖脂浓度对芴降解率的影响结果见图4.

图4 不同鼠李糖脂浓度下芴的降解率

由图4可以看出，鼠李糖脂作为表面活性剂对各物质的降解效果较为明显.鼠李糖脂浓度在100～500 mg/L范围内，芴的降解率先快速增大后缓慢减小.在100～200 mg/L之间时曲线呈上升趋势，走势陡峭，降解率从26.3%达到71.7%，极差达45.4%，变化十分显著.浓度在300～500 mg/L之间时曲线为下降趋势，且较为缓和，降解率下降不到10%.在鼠李糖脂浓度在200～300 mg/L时，对芴有较高降解率.

2.5 多因素交互设计

1) 以菌株X2对芴的降解率为响应值R1，设计4因素3水平共29个实验点的响应面分析实验，实验设计及结果见表1，方差分析见表3.

表2芴响应面设计方案与结果

表3 方差分析表

按照Design-Expert8.0.6软件中Box-BehnkenDesign模型对试验中芴的降解率进行回归分析，得到回归方程如下：

R1=0.84-0.043A-0.015B+0.024C+0.0097D-0.014AB-0.038AC-0.022AD-0.040BC-0.045BD-0.048CD-0.086A2-0.060B2-0.099C2-0.082D2.

式中A、B、C、D分别为表1表2所示的自变量编码值；A： 芴的质量/g，B：温度，C：pH值，D：鼠李糖脂浓度，R1：芴的降解率.

由方差分析表可以得到以下分析：

模型检验结果显示，F值为2.12(P值=0.0862>0.05)，模型拟合度不显著，意味着模型存在8.62%的几率为噪音.在该试验中A2，B2，C2，D2，四个因素各自对F的降解率影响分别为显著、不显著、极显著、显著，对降解率影响力大小为C>A>D>B.模型失拟系数lackoffitF-value=3.6(lackoffitpro=0.1142>0.05)是不显著的.由模型信噪比检验可知道，该模型Adeq精密度为5.888(Adeq精密度大于4是可取的)，即该模型可用于设计空间试验.模型两因素交互作用见图5.

图5 AB交互作用(左：等高线图，右：3D图)

图6 AC交互作用(左：等高线图，右：3D图)

图7 AD交互作用(左：等高线图，右：3D图)

图8 BC交互作用(左：等高线图，右：3D图)

图9 BD交互作用(左：等高线图，右：3D图)

图10 CD交互作用(左：等高线图，右：3D图)

图5、6、7、8、9、10分别显示了AB、AC、AD、BC、BD、CD两因素间的交互作用对芴的降解率影响，图分为等高线图和3D图.等高线图中颜色的变化代表降解率的变化，从而可以对二者的交互情况进行分析.处于同一椭圆上的点其响应值R1(降解率)相同，等高线呈圆形表示两因素之间交互作用不显著，而等高线呈椭圆形表示两因素之间交互作用显著.3D图则能更清楚地显示响应值的变化趋势，因素对试验结果影响越大3D曲面越陡峭[13，14].从图中可对任意两因素之间的交互影响的效应进行分析和评价，从而确定最佳的因素水平范围.模型的两因素交互影响中AB，AC，AD，BC，BD，CD的交互作用对芴的降解率全都不显著.从模型检验结果可以得出，两因素交互作用对芴的降解率影响大小排序为CD>BD>BC>AC>AD>AB.

2.6 验证实验

该实验研究了菌株X2对芴降解的4个单因素影响条件，得出该菌降解芴的较佳条件分别为，芴的质量0.6 g左右(菌悬液5 mL，菌浓度为0.80～1.41×108个/mL)，温度为28 ℃～29 ℃，pH值在7～8.鼠李糖脂浓度在200～300 mg/L时，该菌株对芴有较高的降解率，分别可达82.19%、74.23%、53.95%、71.70%.

利用Box-Behnken对4个单因素结果进行处理，得到了多因素交互设计方案，预测芴最佳降解条件为芴的质量0.51 g、温度28.62 ℃、pH值7.79，鼠李糖脂209.62 mg/L，预期降解率可达84.65%.验证试验3次后结果得到降解率为83.74±1.34%.对二者进行双重比较发现差异性不显著.

3 结论

从近几年生物技术的发展来看，用生物手段来处理环境污染问题十分常见，并取得明显的成果.如用微生物生物处理水中芴，当纳米Fe-Ni双金属添加量为3 g/L、芴初始浓度为0.5 mg/L、温度为30 ℃、pH为5的条件下，去除效果最好，去除率可达到96.2%[8].因此本试验用一株菌来降解芴时具有科学性、合理性.试验结果得到了X2菌降解芴的最佳配比方案，极大地提高了X2菌对芴的降解效果，为X2菌降解其他物质、其他菌对芴的降解、芴的其他降解方案等作参考对比，为环境中污染物特别是多环芳烃类物质的降解处理提供试验思路.

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