中空纤维膜液相微萃取-气相色谱质谱法测定藜麦游离氨基酸

韦柳娟 ，李 佳 ，熊廷楷，张雯殊，李会敏，白仲林

(西北民族大学 化工学院，甘肃 兰州 730030)

藜麦被称为丢失的远古“营养黄金”，联合国粮食及农业组织(Food and agriculture organization of the united nations简称：FAO)已将其列为可以满足人体基本营养需求的惟一一种单一植物.1980年，由美国两位科学家“重新”发现了藜麦极高的营养价值，并带回美国，使藜麦的有机成分被现代文明认识.这种远古植物渐渐走进全球更多人家的餐桌[1-4].

传统的测定氨基酸[5]方法有：按分离方法可分为气相色谱法[6].离子交换法、反相高效液相色谱法[7]等.本实验采用中空纤维膜吸附萃取气质联用的方法[8～9]，探究藜麦中氨基酸提取的较优条件.本实验以PVDF聚偏氟乙烯中空纤维膜为主，以硅胶为填料，并对填料进行了改性，探索不同因素下的最优因素.实验用环糊精改性的硅胶做为填料，也是实验的一大创新之处.

1 材料和仪器

1.1 材料

藜麦：山西稼祺藜麦开发有限公司(货号：JQLM-004，产地：山西朔州).

中空纤维膜：聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜(广州海科有限公司，膜参数：内径900 μm、壁厚300 μm、孔径0.02 μm).

硅胶填料：SP-100-10P(苏州麦可旺公司，填料参数：SP-100-10-P 、粒径10 um、孔径100 A，比表面积450).β-环糊精：98%白色结晶粉末，25 °C下溶解度为1.85，熔点200 °C.上海山浦化工有限公司生产.

丙酮、无水乙醇、甲醇、双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、乙腈、乙酸乙酯、吡啶、正乙烷、二甲基甲酰胺、丙酮(所有等级的分析纯度>99.9%，均为市售分析纯).

氨基酸标样包括α -丙氨酸、β-丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、胱氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、谷酰胺、谷氨酸、天冬氨酸(中国药品生物制品检定所生产).

1.2 仪器

气相色谱-质谱联用仪( 美国热电DSQII)，磁力搅拌器、超声清洗仪、电子天平(上海精密仪器有限公司)、粉碎机、微波炉、恒温水浴锅.

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱： 采用热tr-5 MS柱，30米×内径0.25毫米，0.25 μm厚度.进样口温度：250 ℃.升温程序：初始柱温80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升温至230 ℃，保持1 min.再以5 ℃/min 升温至280 ℃，保持4 min.载气：氦气(纯度≥99.999%)，流速1 mL/min.进样方式：不分流进样.进样量：1 μL.

1.3.2 质谱条件

色谱与质谱接口温度：280 ℃.电离方式：电子轰击源( EI) .监测方式： 选择离子扫描模式( SIM).电离能量： 70 eV.溶剂延迟： 4.4 min.

2 方法

2.1 标准溶液的配制

母液：分析天平称量各个标准物质50 mg(0.050 0 g)稀释于50 mL容量瓶中，丙酮定容(先加约30 mL丙酮超声溶解，不溶部分加少量纯净水继续超声，然后用丙酮定容)，得到1 mg/mL的母液.

其他浓度标液：逐级稀释，先从母液中用移液管取5 mL置于50 mL容量瓶中，丙酮定容，得到浓度为 0.1 mg/mL标液，然后再从0.1 mg/mL的标液中取5 mL置于50 mL容量瓶中.丙酮定容，得到浓度为 0.01 mg/mL溶液，然后再从0.01 mg/mL的标液中取5 mL置于50 mL容量瓶中.丙酮定容，得到浓度为 0.001 mg/mL溶液，最后直至10-4mg/mL.在棕色试剂瓶中避光冰箱保存，待用.每个浓度进样后出现谱图，八个标准氨基酸必须保证有三个峰面积数值相近，然后计算平均面积，用Excel回归出标准曲线及相关系数.

2.2 标准溶液进样

每个浓度均取0.5 mL 置于小导夫管(1.5 mL)中，吹风机低温吹干丙酮后，取0.5 mL衍生化试剂(此实验用BSTFA做衍生化试剂)，微波炉中反应60 s.衍生液每次1 μL进样.衍生液要尽快进样，隔夜的将失效不能用.

2.3 藜麦样品处理

取藜麦样品100 g，粉碎后过60目筛.精密称量1.00 g样品粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中.在此锥形瓶中加25 mL 80%甲醇，称定质量，超声提取60 min，放冷再称定质量.用80%甲醇补足减失的质量.萃取液过滤转移至25 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度.

2.4 β-环糊精改性的硅胶微球制备

硅胶微球依次用1.0 M的盐酸和氢氧化钠进行浸泡处理，用去离子水洗至中性，真空干燥后使用.取5.0 g上述活化微球与5.0 g环糊精混合后，倒入带有搅拌器、冷凝管的三口烧瓶，依次加入三甲基氯硅烷(5 mL)和丙酮10 mL.最后加入NaOH(2.0 g)，温度70 ℃，400 rpm搅拌反应12 h.反应产物过滤后，先用大量热水洗涤，再用丙酮浸洗后真空干燥.

2.5 中空纤维搅拌棒的制备

聚偏氟乙烯中空纤维膜用剪刀剪成长为2 cm的小段，用丙酮在超声波中清洗，除去纤维中的任何可能的杂质.中空纤维膜一端先用打火机密封，后在管腔内插入一根1 cm长的细钢丝.将0.1 g硅胶填料分散在1 mL无水乙醇中，然后用注射器将分散溶液缓慢注入中空纤维内腔.乙醇注入后会渗出和挥发，完成后再用打火机将中空纤维膜另一端密封.

2.6 样品萃取及衍生过程

每次1 mL 藜麦提取液 + 中等浓度标准溶液(0.1～0.001)1 mL+氯化钠(0～0.1 g不等)+中空纤维搅拌棒1根.磁力搅拌萃取若干时间后取出搅拌棒，晾干或吹风机低温烘干，用 0.1 mL BSTFA+0.9 mL乙腈(要淹没搅拌棒)微波炉中衍生1 min左右.

3 结果与讨论

3.1 标准品氨基酸色谱图

标准品氨基酸色谱图见图1.

图1 标准品氨基酸色谱图

各分析物的保留时间和特征离子见表1.

3.2 藜麦氨基酸色谱图

氨基酸色谱图见图2.由图2可知，保留时间为6.4 min左右的氨基酸出峰最明显.根据标准样品氨基酸出峰时间可知，该氨基酸可能为亮氨酸.加入中空纤维搅拌棒后，各个氨基酸的出峰比加入搅拌棒之前出峰明显，原因是中空纤维膜避免了其他不必要的分子出峰.只有氨基酸和其他小分子物质能出峰，所以加入搅拌棒萃取后的藜麦氨基酸更容易被提取.

图2 藜麦氨基酸色谱图

3.3 衍生时间的优化

各衍生时间优化见图3.

衍生时间越长越有利于目标物进入萃取液.在达到平衡后再增加衍生时间对萃取效率影响也不大.若在平衡后继续延长萃取时间，将会导致液膜的不稳定性，从而导致萃取溶液的损失及萃取效率的降低.研究过程中，在室温条件下( 23 ℃左右) 对衍生时间进行优化，发现衍生时间在50 s时氨基酸萃取效果最佳.

图3 衍生时间

3.4 盐析浓度的优化

各盐析浓度优化见图4.

图4 盐析浓度

随着盐浓度增加，蛋白质变性，从而导致蛋白质凝固阻塞.通过搅拌棒萃取控制NaCl的浓度，加入多于0.5 g的NaCl 以后，发现萃取效率大大降低.原因可能是发生了蛋白质的变性，或者其他物质进入纤维膜，阻碍了氨基酸的萃取.

3.5 测定方法精密度

测定方法精密度见表1.

在确定的优化条件下，按照实验方法对含有标准品的样品( 按照2.1制备) 及藜麦样品(按照2.6制备)进行中空纤维膜液相微萃取，标准品谱图见图1，藜麦谱图见图2.取n=3计算检出限、定量限，标准偏差见表1.藜麦的检出限在0.000 03 mg·mL-1～0.017 mg·mL-1之间，定量限在0.000 1 mg·mL-1～0.05 mg·mL-1之间，相对标准偏差为0.219%～0.892%.结果表明，本法具有良好的精密度要求.藜麦中八种氨基酸含量结果见表2.

3.6 藜麦中氨基酸含量

藜麦样品中八种氨基酸的含量见表2.

表1方法精密度

表2 藜麦中氨基酸含量

采用中空纤维搅拌棒萃取后，控制其他变量相同，改变衍生时间和盐析浓度.从图3、图4可知，衍生时间为50 s、盐析浓度为0.05 g时，氨基酸最易析出.在藜麦样品中，亮氨酸的含量最多的为0.031 2 mg/mL.由图3、4还可知，优化因素为可控的.例如衍生萃取时间越长，越有利于目标物进入萃取液.在达到平衡后再增加衍生萃取时间，对萃取效率增加影响不大.根据氨基酸种类和性质的不同，优化因素对氨基酸的影响不同.藜麦样品中含量最少的蛋氨酸，在这两个优化因素的条件下出峰都不是很明显.由此可得，氨基酸含量是影响出峰面积的一个很重要的因素.

4 结论

采用中空纤维膜液相微萃取技术结合气相色谱质谱法测定藜麦中的游离氨基酸，方法简单、试剂用量少，具有绿色环保的优点，还有较高富集倍数，能有效地降低检测限，提高灵敏度，具有良好的回收率和检测限.本方法广泛适用于很多物质的分析，不需要预处理和清洁的氨基酸就能直接提取衍生物.制备的搅拌棒也可重复利用，符合绿色化学的要求.

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