油橄榄叶提取物对非酒精性脂肪肝小鼠脂肪酸β氧化限速酶CPT-1表达的影响

王 昱

(陇南师范高等专科学校农林技术学院 陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 成县 742500)

在肝脏相关代谢类疾病中，脂肪肝是危害人类健康的第二大肝病，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是遗传、环境、代谢应激相关性疾病，现已成为世界慢性肝病的重要病因，可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发等特点，但确切发病机制目前仍不清楚[1，2].多酚、黄酮及橄榄苦苷是油橄榄叶主要活性成分.已有大量研究证实，油橄榄叶提取物在排铅、海洛因脱毒、预防糖尿病、抗衰老、减轻缺血再灌注损伤等方面表现出突出的效果[3-12]，具有调节肝脏抗氧化能力、改善非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠肝功能的作用[13].为进一步阐明其作用机制，本研究拟以小鼠为实验材料建立非酒精性脂肪肝动物模型，探讨肝细胞脂肪酸β氧化的调控因子，观察油橄榄叶提取物(olive leaf extract，OLE)对NAFLD的影响，以揭示OLE防治NAFLD的作用机制.

1 材料与方法

1.1 材料

油橄榄叶提取物(陇南田园油橄榄科技开发有限公司)；兔抗CPT-1抗体、免疫组织化学试剂盒和DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)；RNA抽提试剂盒、反转录试剂、定量PCR试剂(Taka Ra公司)，PCR引物由上海涵悦生物科技有限公司设计，上海生工生物技术有限公司合成.

高速台式冷冻离心机(Beckman美国TGL-16M)等；7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪(美国ABI)；核酸蛋白分析仪(美国贝克曼库尔特公司).40只清洁级昆明小鼠(购于兰州大学实验动物中心，许可证号：SCXK(甘)2009-0004)，体质量18～20 g，雌雄各半.

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立与给药

健康昆明小鼠40只，随机分为4组，即正常组、模型组、OLE低剂量组(I)、OLE中剂量组(II)和OLE高剂量组(III)，每组10只.参照文献[14]，正常组普通饲料喂养，其他各组每天给高脂饲料(繁殖鼠料54.8%，18.9%猪油，1.3%胆固醇，0.3%胆盐，11.2%蔗糖，8.7%酪蛋白，1.8%预混料及3%麦芽糊精)喂养9周，从造模第2周起正常组和模型组灌胃0.1 mL/10g·d-1生理盐水，I、II、III治疗组分别灌胃250、500、1 000 mg/kg OLE，每日1次，连续给药8周.

1.2.2 PCR检测肝组织CPT-1 mRNA 的表达

取小鼠肝脏，放入2 mL 的离心管，加入1 mL Trizol后用匀浆器反复研磨，离心(14 000 r / min)10 min，取上清液通过酚-氯仿抽提RNA.将抽提的RNA 进行逆转录反应，实时荧光PCR扩增.PCR按照试剂盒说明书进行操作，25 μL 反应体系.反应条件： 预变性 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；40个循环中 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s.计算目的产物CPT-1 mRNA 和内参照 β-actin 灰度值的比值( CT 值) 来反映其相对含量.取 3 次重复实验结果的均值进行比较，引物序列见表1.

表1目的基因引物序列

1.2.3 免疫组织化学

免疫组化SP法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法).末次给药后，取大鼠肝脏数块置于4%多聚甲醛固定，经脱水、石蜡包埋后冠状位切片，厚6 μm.脱蜡、抗原修复后，用3% H2O2室温孵育10 min，正常兔血清室温封闭30 min，然后用兔抗鼠CPT-1多克隆抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜.次日取出切片以PBS冲洗后，再依次滴加生物素化羊抗兔IgG孵育30 min，SABC工作液孵育30 min.最后DAB显色，苏木素复染，空白对照以PBS代替一抗.常规乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，在显微镜下观察并拍照.

1.2.4 图像分析

用美国Image-proplus 5.0 专业图像分析软件进行图像分析.从CPT-1阳性反应的切片中各选3 张，检测活性物质在肝脏中表达的强度.测量时保证光源的稳定，并且取图之前预热20 min以上.采图时各项设置包括光源、光圈大小、白平衡、曝光强度、敏感度、对比度等均改为手动调节且固定，以保证每次取图系统的设置值一样.取平均光密度和积分光密度两个指标，测量值的平均值为最终灰度值.

1.2.5 数据处理

2 结果

2.1 OLE对NAFLD 小鼠肝组织CPT-1 mRNA表达的影响

由图1可知，模型组小鼠肝组织CPT-1 mRNA表达量较正常组显著降低(P<0.01)；I、II、III治疗组小鼠肝组织CPT-1 mRNA表达量较模型组显著升高(P<0.05，P<0.01).

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05).下同.

图1 OLE对NAFLD小鼠肝组织CPT-1 mRNA表达的作用

2.2 OLE对小鼠肝脏CPT-1蛋白表达的影响

免疫组织化学显示：CPT-1蛋白在各实验组小鼠肝脏中都有不同程度的阳性表达.阳性表达部位被染成棕黄色，阴性对照组无CPT-1蛋白阳性表达(图2).与正常组相比，模型组小鼠肝脏CPT-1蛋白的表达水平减弱、阳性细胞数减少(P<0.01).各给药组与模型组比较，小鼠肝脏CPT-1蛋白的表达增强、阳性细胞数增加(P<0.05，P<0.01，图3).

图3 各组小鼠肝脏CPT-1蛋白表达的比较

3 讨论

NAFLD是一种遗传-环境-代谢应激相关性疾病，发病原因目前尚不能以单一的机制解释，比如西方学者提出的“二次打击”学说，中医认为“痰凝血瘀”、“ 阳气不通”是NAFLD的关键病机[15].中药具有活性成分多、作用靶点多、给药途径多、不良反应小等特点，显示出良好的临床疗效和安全性.油橄榄叶主要活性成分是多酚、黄酮及橄榄苦苷.前期实验已证实，油橄榄叶提取物具有抗氧化损伤、减少炎症因子分泌、调节血脂的药效学效应[13].因此，本实验选用OLE进一步探讨其对肝细胞脂质变性的防治作用和可能机制.

肉毒碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferase，CPT)分为CPT-1和CPT-2两类.CPT1是脂肪酸β氧化过程中的限速酶，位于线粒体外膜，是脂肪酸进入线粒体流量的关键调控位点，催化长链脂肪酸从酰基辅酶A转移到肉毒碱上，进而从胞浆进入线粒体内部，并且进一步在位于线粒体内膜上的CPT-2催化下进行β氧化，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用[16].CPT-1 mRNA 表达水平的明显下降可导致脂肪酸活化产物脂酰辅酶A向线粒体内转运减少，使已进入细胞的脂肪酸及其活化产物脂酰辅酶 A 沉积在胞浆内，从而加剧细胞内大量脂质堆积[17，18].本实验结果显示，模型组小鼠肝组织CPT-1表达水平明显降低，经OLE干预后，肝组织CPT-1表达水平均呈上升趋势.表明OLE 对其有上调作用.研究[19，20]表明，降低CPT-1在肝脏中的表达，能调节血脂水平，提示活化CPT-1调控线粒体代谢可能是OLE发挥改善脂质代谢紊乱分子机制.

综上所述，OLE能够减轻NAFLD小鼠肝细胞内脂肪沉积，提高CPT-1 的表达水平，调节脂肪酸β氧化.CPT-1作为脂肪酸代谢过程中的关键酶，对脂肪肝的发生发展起着重要作用.而以CPT-1为靶点进行脂肪肝治疗的化学药物开发较少.同时，发现并明确机理的天然物质也几乎没有.该实验为研发OLE制剂防治肝损伤相关疾病提供了理论与实验依据，因此具有良好的开发前景.

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