沉默β-catenin表达对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响与作用机制研究

潘安萍 朱建伟 王忻妍

β-链蛋白（β-catenin）是一种多功能的蛋白质。在正常细胞内，β-catenin多数位于细胞膜，与E钙黏蛋白及α-catenin一起在细胞间的黏附中发挥关键作用[1]。β-catenin若脱离细胞膜进入细胞质，易被降解，但当β-catenin在细胞内发生降解异常时，β-catenin会在细胞内堆积，进入细胞核促进下游靶基因的转录，即β-catenin的另一重要功能-参与Wnt信号通路[2]。β-catenin下游靶基因编码许多调节细胞生物学行为的相关蛋白，如 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶（MMP）-7等，即β-catenin作为转录因子有可能影响细胞增殖、分化、侵袭、转移等多种生物学行为，且有研究发现β-catenin在多种肿瘤细胞中明显高表达[3]。基于此，本研究应用干扰慢病毒感染β-catenin相对高表达的胃癌细胞株MGC-803，沉默其细胞内β-catenin表达，而后通过多种实验方法观察β-catenin表达下调对MGC-803细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等生物学行为的影响，同时检测沉默β-catenin表达后的MGC-803细胞中Bcl-2、Bax、cyclin D1和MMP-7等蛋白表达水平的变化，初步探讨β-catenin下调影响胃癌MGC-803细胞生物学行为可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞与主要试剂 MGC-803细胞株购自上海博谷生物科技有限公司。β-catenin-RNAi慢病毒液、βcatenin-Neg慢病毒液购于上海吉玛公司；凋亡检测AnnexinV-PE/7-AAD试剂盒、细胞周期碘化丙啶（PI）染色试剂盒购于南京凯基生物有限公司；Matrigel胶购于美国BD公司；兔抗人β-catenin单克隆抗体购于美国Santan Cruz公司；鼠抗人β-actin、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP单克隆抗体均购于中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 分别将购买的β-catenin-RNAi慢病毒及β-catenin-Neg慢病毒感染MGC-803细胞，实验分组：实验组（感染β-catenin-RNAi慢病毒的MGC-803-RNAi细胞）、阴性对照组（感染空载慢病毒的MGC-803-Neg细胞）、空白对照组（未处理的MGC-803细胞）。

1.2.2 病毒感染与细胞培养 根据预实验得知该病毒对MGC-803细胞的感染复数约为100，将MGC-803细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后实验组与阴性对照组细胞分别滴加相应慢病毒液，空白对照组加等体积培养基。24h后换液，3d后荧光倒置显微镜下观察细胞荧光染色情况。感染效率=带绿色荧光细胞数/总细胞数×100%。

1.2.3 Western blot检测细胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7表达水平 用蛋白提取试剂盒提取各组细胞内的总蛋白，分别取20μl进行聚丙烯凝胶电泳，结束后目的蛋白条带转移至硝酸纤维素（NC）膜，5%的脱脂奶粉封闭1h，一抗（1:1 000）4℃封闭过夜，二抗（1:2 500）室温封闭1h。暗室内用发光液进行曝光、显影、定影，得到目的蛋白条带的胶片，用Image J软件检测各组细胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7相对表达水平。实验重复3次取平均值。

1.2.4 Annexin-V-PE/7-AAD双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率 将各组细胞分别接种于6cm培养皿常规培养。待细胞长至约80%～90%融合度时收集细胞，PBS洗涤2次，加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，加入1 μl Annexin V-PE染液，室温、避光、反应15min，加入5 μl 7-AAD染液，室温、避光、反应15min。过300目尼龙网后1h内进行流式细胞术检测细胞凋亡率。实验重复3次取平均值。

1.2.5 PI单染流式细胞术检测各组细胞周期 取各组细胞分别接种于6cm培养皿常规培养，待细胞长至约80%～90%融合度时收取细胞，每组细胞取约1×105个。用PBS清洗2次后用预冷的75%乙醇溶液1ml重悬细胞沉淀，4℃固定过夜。第2天1 000r/min离心5min后去固定液，PBS清洗2次，加入100μl的RNase A重悬细胞沉淀，置于37℃水浴锅内30 min，加入PI染料400μl，4℃避光染色30min。过300目尼龙网后，流式细胞术检测细胞周期。实验重复3次取平均值。

1.2.6 Transwell法检测细胞的侵袭能力 将融好的Mtrigel胶与含10%BSA的1640培养基按体积比1:6混合，后取50μl平铺于小室的上室面。收集各组细胞，PBS清洗2次，用完全培养基稀释成1×105/ml的细胞悬液。小室的下室面各加入含10%FBS的1640完全培养基500μl，上室面加入200μl各组细胞悬液，培养24h后取出小室，擦拭上室面未穿膜的细胞后结晶紫染色，显微镜下计数穿膜细胞数分析细胞侵袭能力。实验重复3次取平均值。

1.3 观察指标 观察并比较MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞荧光染色情况、β-catenin 表达水平、细胞凋亡率、细胞周期、侵袭能力，以及Bcl-2、Bax、cyclin D1、MMP-7 蛋白表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件；计量资料以表示，3组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞荧光染色情况比较 感染4d后，荧光显微镜下可见MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞显示强绿色荧光，且带绿色荧光的细胞数占总细胞数比例均超过80%，而MGC-803细胞无绿色荧光，即MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞慢病毒感染效率＞80%。MGC-803-RNAi细胞荧光染色情况见图1（插页）。

图1 MGC-803-RNAi细胞荧光显微镜下所见（×100）

2.2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞β-catenin表达水平比较 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞β-catenin相对表达水平分别为0.8725±0.0110、0.8593±0.0074、0.4220±0.0164，3 组比较差异有统计学意义（P＞0.05），MGC-803-RNAi细胞β-catenin表达水平较MGC-803、MGC-803-Neg细胞下调（均P＜0.05），而MGC-803-Neg细胞与MGC-803细胞间比较无统计学差异（P＞0.05）。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞 β-catenin蛋白电泳图比较见图2。

图2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞 β-catenin蛋白电泳图比较（a：MGC-803 细胞；b：MGC-803-Neg细胞；c：MGC-803-RNAi细胞）

2.3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞凋亡率比较 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞凋亡率分别为（1.20±0.26）%、（1.35±0.35）%、（8.52±0.82）%，3组比较差异有统计学意义（P＞0.05），MGC-803-RNAi细胞凋亡率高于 MGC-803、MGC-803-Neg细胞（均P＜0.05），而 MGC-803-Neg细胞与MGC-803细胞间比较无统计学差异（P＞0.05）。流式细胞术检测 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞凋亡率比较见图3。

图3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞凋亡率比较（a：MGC-803 细胞；b：MGC-803-Neg细胞；c：MGC-803-RNAi细胞）

2.4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞周期比较 以S/G1期细胞比例为观察指标，MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞分别为 （1.11±0.05）%、（1.09±0.10）%、（0.78±0.08）%，3 组比较差异有统计学意义（P ＞0.05），MGC-803-RNAi细胞 S/G1期比例低于 MGC-803、MGC-803-Neg细胞（均P＜0.05），而MGC-803-Neg细胞与MGC-803细胞间比较无统计学差异（P＞0.05）。流式细胞术检测MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞周期结果比较见图4（插页）。

图4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞周期结果比较（a：MGC803 细胞；b：MGC803-Neg细胞；c：MGC803-RNAi细胞）

2.5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞侵袭能力比较 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞穿膜染色数分别为（109.80±5.36）、（104.40±7.47）、（54.00±6.28）个，3 组比较差异有统计学意义（P＞0.05），MGC-803-RNAi细胞侵袭能力低于 MGC-803、MGC-803-Neg细胞（均P＜0.05），而 MGC-803-Neg细胞与MGC-803细胞间比较无统计学差异（P＞0.05）。Transwell法检测 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞侵袭能力实验结果见图5（插页）。

图5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi穿膜细胞显微镜下所见比较（a：MGC803 细胞；b：MGC803-Neg 细胞；c：MGC803-RNAi细胞；结晶紫染色，×200）

2.6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi 细胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7蛋白表达水平比较 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（均P＞0.05），MGC-803-RNAi细胞Bcl-2、cyclin D1、MMP-7蛋白表达水平均低于MGC-803、MGC-803-Neg细胞（均P＜0.05），Bax蛋白表达水平高于 MGC-803、MGC-803-Neg细胞（均P＜0.05），而MGC-803-Neg细胞与MGC-803细胞间比较无统计学差异（P ＞0.05）。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7 蛋白电泳图比较见图6。

3 讨论

β-catenin是一种多功能、进化保守的蛋白质分子，在多细胞生物的胚胎发育及机体稳态中发挥至关重要的作用。研究发现，在肿瘤的发生、发展过程中，一方面β-catenin作为一种转录活化因子，能介导多种原癌基因与细胞周期调控基因的转录翻译，促进细胞增殖、侵袭及转移，抑制细胞分化、凋亡，还能诱导肿瘤耐药，另一方面，肿瘤细胞中β-catenin在细胞质内的异常定位导致细胞膜上β-catenin含量下降，易使癌细胞间黏附功能下降，致肿瘤细胞更易于脱离原发部位而发生远处转移[3]。β-catenin参与调控上述生物学行为的靶基因编码蛋白包含 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、MMP-7、P-gp等[3]。本研究选取β-catenin相对高表达的胃癌MGC-803细胞进行实验，通过干扰慢病毒感染MGC-803细胞，经感染成功的MGC-803细胞在荧光显微镜下有明显的荧光显示；并通过Western blot法证实MGC-803-RNAi细胞β-catenin表达水平明显下调。本研究再将此稳定穿代的3株细胞（MGC-803-RNAi、MGC-803-Neg及MGC-803细胞）进行后续实验，以了解βcatenin表达下调对MGC-803细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制。

图6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi细胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白电泳图比较（a：MGC-803细胞；b：MGC-803-Neg细胞；c：MGC-803-RNAi细胞）

本研究采用Annexin-V-PE/7-AAD双染流式细胞术证实β-catenin表达的下调可促进MGC-803细胞凋亡。这与在肠癌细胞中得到的结果一致[4]。细胞凋亡过程主要受Bcl-2蛋白家族所调控，其中最具代表性的为Bax及Bcl-2蛋白，Bax促进细胞凋亡，而Bcl-2抑制细胞凋亡[5]。本研究检测到沉默β-catenin表达之后的MGC-803-RNAi细胞Bcl-2表达水平明显下调，而Bax表达水平则相对上调，结果同预期。笔者推测，β-catenin表达异常对MGC-803细胞凋亡的影响，其机制与影响Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白Bax及Bcl-2的表达有关。cyclin是一类在细胞周期中发挥关键调节作用的蛋白，其中cyclin D1能调细胞周期由G1期顺利进入到S期[6]。本研究干扰MGC-803细胞β-catenin的表达后发现MGC-803-RNAi细胞cyclin D1表达水平也下调，且出现明显的G1期阻滞，细胞增殖减弱。这与Shtutman等[7]研究结果相符。笔者推论，沉默β-catenin表达使MGC-803细胞阻滞在G1期，其作用机制与Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白cyclin D1表达下调有关。

胃癌细胞转移是胃癌患者治疗失败的主要原因。β-catenin作为细胞黏附中的关键因子，当其在细胞膜中减少时，细胞间黏附功能下降，导致肿瘤细胞易脱离原发部位。但是游离出来的肿瘤细胞要在细胞间质中进行迁徙，必须能够分解细胞外基质。在细胞外基质的众酶中，MMP起着关键的作用[8]。研究显示，MMP家族蛋白酶的表达受Wnt/β-catenin信号通路调控，其中MMP-7蛋白与肿瘤关系最密切，MMP-7普遍被发现在肿瘤组织及细胞中明显高表达，且MMP-7在相对晚期的胃癌组织中阳性率明显高于相对早期的胃癌组织[9]。本研究通过Transwell实验方法发现，沉默β-catenin表达之后，MGC-803-RNAi细胞的侵袭力显著下降，且MGC-803-RNAi细胞内MMP-7的表达水平也明显下降。因此推论β-catenin沉默抑制MGC-803细胞侵袭能力与Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白MMP-7表达水平下调有关。这一结果与在肠癌、食管癌中的研究相似[10]。

综上所述，本研究结果显示，β-catenin表达下调可影响胃癌MGC-803细胞的增殖、凋亡、侵袭等多种生物学行为，其作用机制可能与影响Wnt/β-catenin信号通路下游多种靶蛋白表达有关。

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