乌梅有机酸的提取工艺及其抑菌活性

张丹丹，姜修婷

(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266000)

乌梅别名酸梅、黄仔、合汉梅或干枝梅，为蔷薇科落叶乔木植物梅Prunusmume的近成熟果实，经烟火熏制而成[1-2]。乌梅始载于《神农本草经》，为收涩药，性平味酸，归肝、脾、肺和大肠经，具有敛肺涩肠、生津止渴和驱虫止痢的功效，可用于肺虚久咳、久痢滑肠、虚热消渴和胆道蛔虫症等[3]。现代医学研究表明：乌梅主要功能为抑菌、护肝，具有抗肿瘤、抗过敏、抗氧化、抗生育和治疗结肠炎等作用[4]。乌梅的主要成分为有机酸、氨基酸、糖类、挥发油、脂类、甾醇类、生物碱和黄酮类等。其中有机酸类可以软化血管，延缓血管硬化，具有防老抗衰、抗菌作用[5]。

张小琼等[6]、杨莹菲等[7]以及Seneviratne等[8]的实验表明：乌梅醇煎液对炭疽杆菌、白喉和类白喉杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌(金黄色、柠檬色和白色)及肺炎球菌皆有抑制作用，对大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒、副伤寒杆菌、绿脓杆菌和霍乱弧菌等肠内致病菌也有效果，而对甲或乙种链球菌无作用。体积分数为50%乌梅煎液(纸片法)对百日咳杆菌和脑膜炎球菌作用效果最强，对肺炎球菌和溶血性链球菌作用效果中等，对牛型布氏杆菌和白喉杆菌也有作用，而对流感杆菌和绿色链球菌无作用。乌梅乙醇浸液对一些革兰阳性和阴性细菌以及人型结核杆菌皆有显著抗菌作用[9]。乌梅粉在培养皿上对白色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌及伤寒杆菌作用效果较强。

目前，在对乌梅有机酸提取工艺研究中以热回流法较多。热回流法提取效率较高，但溶剂消耗量大，操作较麻烦，耗时耗能；并且由于操作的局限性，在实际生产中较少被采用。超声波提取法是近年来发展起来的一种有效的物质提取方法，具有有效成分提取率高、时间短、温度低和适用范围广等优点;利用超声波的机械效应、热效应与空化效应，使得有效成分能更好地在溶剂中溶解与扩散，因此可有效提高产物的得率。

笔者及所在课题组采用超声波提取法对乌梅有机酸的提取工艺进行了研究，对其具体参数进行了优化，并对其抑菌活性进行了评价，以便提高乌梅有机酸得率，从而达到更好的抑菌效果，以期为乌梅的合理炮制奠定实验基础，以及为今后深入研究和开发应用乌梅提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

乌梅粉,由新鲜乌梅晒干后粉碎，粒度为840 μm，西安四季生物科技有限公司；枸橼酸标准品,上海哈灵生物科技有限公司；NaOH(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、NaCl(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨和琼脂,北京陆桥技术有限责任公司；菌种(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和四联球菌)，由青岛绿谷菌种保藏中心提供。

1.2 实验仪器

M297714型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DZKW-4型电子恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；SK60-09119 4型两装高速中药粉碎机，北京中西远大科技有限公司；KH-250DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；P7021TP-6型微波炉，佛山市格兰仕电器有限公司；SW-CJ-1F型单人净化双面工作台，上海予卓仪器有限公司；ZDJ-5B型自动滴定仪，上海雷磁仪器厂；立式压力蒸气灭菌器，GZX-9240 MBE型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；生化培养箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 培养基制备

1.3.1 液体培养基

准确称取NaCl 0.25 g、牛肉浸膏 0.15 g、蛋白胨0.5 g于50 mL小烧杯中，加入50 mL蒸馏水搅拌均匀后，即得液体培养基(澄清透明的淡黄色溶液)[10]。用质量分数为15%的NaOH溶液调pH至7.4～7.6，再用移液管移取已配好的培养基置于试管中，20 mL试管中移取4 mL，50 mL试管中移取5 mL分装于12支试管中，用硅胶塞塞住试管口。用报纸包裹后放入灭菌锅中，121 ℃高温蒸气灭菌15 min。冷却后取出培养基，分别接种大肠杆菌、四联球菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌，每种菌种分别用4个培养基。

1.3.2 固体培养基

准确称取NaCl 5 g、牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g放入1 000 mL大烧杯中，加水1 000 mL，搅拌均匀，调节pH至7.4～7.6，再加入琼脂15～20 g，把大烧杯放在加热套上加热，并不断搅拌至溶液呈淡黄色澄明状态。把1 000 mL的固体培养基平均倒入已灭菌的4个大锥形瓶中，塞上硅胶塞。用报纸包裹好瓶口放入灭菌锅中，121 ℃高温蒸气灭菌15 min。冷却至不烫手后，取出4个锥形瓶。把已配好的4种液体培养基分别倒入4个锥形瓶中，轻轻摇匀。把锥形瓶中的液体倒入培养皿中，至稍高于培养皿高度的一半即可，大约可倒4～6个培养基。

1.4 乌梅有机酸得率的测定方法

将提取的乌梅提取液经抽滤浓缩成浸膏后,用水稀释，然后采用电位滴定法[11]，用NaOH滴定液(0.1 mol/L)进行滴定。每1 mL的NaOH滴定液(0.1 mol/L)相当于6.404 mg的枸橼酸(C6H8O7)[12]。

1.5 提取工艺的单因素试验

1.5.1 乌梅中有机酸的提取方法考察

分别考察冷浸提取法、热回流提取法、超声波提取法和微波提取法对乌梅中有机酸得率的影响[13]。具体方法：每份均取乌梅粉2 g，按料液比(g/mL)为1∶ 25加入体积分数95%的乙醇溶液，按各提取方法处理(冷浸为24 h，热回流为1 h，超声为30 min和微波为5 min)后，提取溶液减压抽滤后得到滤液，浓缩成浸膏，将粗提物用蒸馏水定容或溶解，定容后用NaOH滴定液进行滴定，从而得出其有机酸的含量。

1.5.2 乌梅中有机酸提取乙醇浓度的考察

采用料液比(g/mL)1∶ 25，提取时间60 min，超声100 kHz，温度60 ℃，分别按80%、85%、90%、95%和100%的乙醇体积分数配制好乙醇溶液后，按料液比(g/mL)1∶ 25备好平行4组实验，得乌梅提取液[14]，经抽滤、浓缩成浸膏，将粗提物用蒸馏水溶解定容，后用NaOH滴定液进行滴定，计算有机酸的含量，筛选有机酸得率较高的条件，再进行下一步试验。

1.5.3 乌梅中有机酸的提取时间考察

采用体积分数为95%的乙醇，料液比(g/mL)1∶ 25，超声100 kHz，温度60 ℃，提取时间分别为30、40、50、60和70 min平行5组试验得乌梅提取液，经抽滤、浓缩成浸膏，将粗提物用蒸馏水溶解定容，后用NaOH滴定液进行滴定计算有机酸的含量，分别测定提取液中有机酸得率。

1.5.4 乌梅中有机酸的提取超声频率考察

采用体积分数95%的乙醇，提取时间60 min，料液比(g/mL)1∶ 25，温度60 ℃，超声频率分别为70、80、90、100和110 kHz进行平行5组试验得乌梅提取液后配制溶液，测定有机酸含量，并计算出有机酸得率。

1.5.5 乌梅中有机酸的提取料液比考察

采用体积分数95%的乙醇，提取时间60 min，超声100 kHz，温度60 ℃，配制好乙醇溶液后，按料液比(g/mL)分别为1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30和1∶ 35的比例,进行平行的5组试验后配制溶液，测定有机酸含量并计算出有机酸得率[15-16]。

1.6 正交试验

在单因素试验的基础上选择优化后的试验因素，以有机酸得率为评价指标，采用四因素三水平的正交试验，按照L9(34)正交表进行试验优化各因素水平，以优化超声提取法提取乌梅中有机酸的最佳工艺参数[17]。

1.7 验证试验

按照正交试验考察后的工艺条件进行提取，得到3批乌梅有机酸提取液，经抽滤、浓缩成浸膏，将粗提物用蒸馏水溶解定容后，用NaOH滴定液进行滴定，计算有机酸得率。

1.8 抑菌试验

抑菌试验采用打孔法[18]。具体操作步骤：用打孔器在含菌培养基上打出直径为5 mm的圆孔，用微量移液器注射100 μL水溶乌梅提物于圆孔中，重复3次，以质量分数1%的硫酸链霉素水溶液为药物对照，以无菌水为空白对照。倒置平皿37 ℃培养18 h后，用游标卡尺量取抑菌直径，得抑菌圈计算公式：抑菌圈直径=抑菌直径-5。

最低抑菌质量浓度(MIC)的测定：取无菌96孔板，于A～F行第1～9孔内加入培养液100 μL，然后第1孔中加入受试药物(500 mg/mL，以生药计)100 μL，混匀后取出100 μL移至第2孔中，依此类推进行倍比稀释至第7孔，混匀后弃去100 μL。药物最终质量浓度依次为(以生药计)250、125、62.5、31.25、15.625和7.812 5 mg/mL。其中C 和F 行第1～7孔内不加菌液，加无菌生理盐水100 μL，作为阴性对照；A、B、D和E行第1～7孔分别加入4种菌液100 μL，作为样品组；第8列不加药物，加入菌液100 μL，作为阳性对照；第9列加入无菌水100 μL，混匀后取出100 μL弃去，不加菌液，加无菌生理盐水100 μL，作为空白对照。将96孔板置于37 ℃生化培养箱中培养18 h，观察孔内细菌生长情况，澄清者为无菌生长，混浊者为有菌生长。无菌生长的各孔中，质量浓度最低的孔对应的浓度即为MIC。

2 结果与讨论

2.1 提取工艺单因素试验结果

2.1.1 乌梅中有机酸提取方法的确定

考察乌梅中有机酸的提取方法,结果见图1。由图1可知：微波提取和冷浸法的提取效果不佳；热回流提取有机酸得率较好，但耗时较长；超声波提取法下的有机酸得率最高，耗时短且操作简单。由此确定提取方法为超声波提取法，并进一步考察单因素试验。

图1 提取方法对有机酸得率的影响Fig.1 The influence of the extraction method to the organic acid yield

2.1.2 乌梅中有机酸提取乙醇分数的确定

考察乌梅中有机酸得率随乙醇体积分数的变化，结果见图2。由图2可知：乙醇体积分数小于95%时，随着乙醇体积分数增大，有机酸得率显著增大；但在乙醇体积分数大于95%时，随乙醇体积分数增大而有机酸得率下降。分析原因，一方面可能是由于有机酸在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物，而有机溶剂具有氢键断裂的作用，因此复合体系有利于有机酸的提取；另一方面可能是由于乙醇的溶剂分子与水分子之间作用力不同而造成其对有机酸溶解性能的改变。因此，综合考虑选择体积分数95%为最佳的乙醇提取浓度。

图2 乙醇体积分数对有机酸得率的影响Fig.2 The influence of the ethanol concentration to the organic acid yield

2.1.3 乌梅中有机酸提取时间的确定

考察乌梅中有机酸得率随热浸时间的变化，结果见图3。由图3可知：热浸时间在60 min前，有机酸得率随提取时间延长而显著增大；而60 min后，有机酸得率有所下降。从理论上来说，提取时间越长，提取也应该越充分。但是在提取过程中会有空气进入提取液，使有机酸类物质与O2接触，从而发生氧化、聚合等反应，使有机酸提取率下降。在实际生产中，延长提取时间，还会延长生产周期，提高生产成本，增大能量消耗。因此，选择最佳提取时间为60 min。

图3 提取时间对有机酸得率的影响Fig.3 The influence of the extraction time to the organic acid yield

2.1.4 乌梅中有机酸提取超声频率的确定

考察乌梅中有机酸得率随超声频率的变化，结果见图4。由图4可知：在超声频率为70～100 kHz时，有机酸得率随超声频率的增大而增大，超声频率为100 kHz时，有机酸得率达11.28%。当超声频率超过100 kHz时，有机酸的得率开始降低，这可能是因为超声频率越大对细胞的破碎作用越强；但当超声频率超过一定范围时，提取液流动速度加快，减少了物料在超声场中的停留时间，细胞破碎作用也就随之减弱[19]。另外，高功率作用可能会导致有机酸成分的降解，从而影响有机酸得率。因此,综合考虑选择超声频率以100 kHz为宜。

图4 超声频率对有机酸得率的影响Fig.4 The influence of the ultrasonic frequency to the organic acid yield

2.1.5 乌梅中有机酸提取料液比的确定

考察乌梅中有机酸得率随料液比的变化，结果见图5。由图5可知：料液比(g/mL)在1∶ 25前，随着乙醇量的增加，有机酸得率逐渐增大，但在料液比(g/mL)为1∶ 25后，有机酸得率反而下降。这是因为在传质过程中，随着提取溶剂逐渐增加，溶液中有机酸质量浓度逐渐稀释，增加了固相与液相间有机酸浓度差，传递速度加快；当料液比(g/mL)达到1∶ 25时，有机酸得率达到最大值，但料液比(g/mL)大于1∶ 25时有机酸得率开始下降，可能是因为料液比过大时，超声波破碎细胞的阻力增大，使细胞破碎程度下降，从而降低了有机酸得率[20]。另外，料液比越大，在浓缩过程中消耗的时间越长，使有机酸被氧化的可能性提高，同时也增大了浓缩时的能量消耗。因此，综合考虑有机酸得率和节约原料，最终选择最佳料液比(g/mL)为1∶ 25。

图5 料液比对有机酸得率的影响Fig.5 The influence of the material liquid ratio to the the organic acid yield

2.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，以有机酸得率为主要考查指标，采用L9(34) 正交试验考察(A)乙醇体积分数、(B)料液比(g/mL)、(C)超声提取时间和(D)超声提取频率对乌梅中有机酸提取的影响。

根据单因素结果设计正交试验因素及水平见表1，结果见表2，各效应的曲线图见图6。

根据表2中极差R分析可知:影响有机酸得率的因素中A、B这2个因素对乌梅中有机酸得率的影响均具有显著性，其中料液比对有机酸得率的影响最大，而超声提取时间和频率对有机酸得率的影响相对较小，且主次顺序为B、A、D和C。

由正交试验所确定的提取有机酸的最佳提取方案是A2B2C2D3，即提取溶剂为95%乙醇溶液(体积分数)、料液比(g/mL)为1∶ 25、提取时间为60 min以及提取频率为100 kHz。

表1 正交试验因素及水平

表2 正交试验设计及结果

图6 各因素效应影响曲线Fig.6 The effect curve of each factor

2.3 验证试验结果

选择最佳提取工艺参数：超声波提取法，提取溶剂为95%乙醇溶液(体积分数)、料液比(g/mL)为1∶ 25、提取时间为60 min、提取频率为100 kHz，进行3次平行验证实验，乌梅有机酸得率结果分别为12.17%、12.25%和12.11%，平均值为12.17%，相对标准偏差(RSD)为0.57%，表明利用正交试验进行乌梅总有机酸提取工艺优化是可行的。

2.4 抑菌试验结果

最佳提取工艺下得到的乌梅有机酸提取物经抽滤浓缩处理后，再用适量蒸馏水溶解，加入到含菌培养基中进行抑菌试验和最小抑菌质量浓度试验，抑菌圈试验结果分别见图7和表3，最小抑菌质量浓度试验结果见表4。由表4可知：乌梅有机酸提取液在31.25 mg/mL时，对大肠杆菌、四联球菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑制作用。对应的抑菌圈直径分别为10.23、9.58、8.93和9.97 mm，4种菌种其最小的抑菌质量浓度分别为31.25、31.25、15.625和15.625 mg/mL。

图7 抑菌圈试验Fig.7 Inhibition zone tests

实验组抑菌圈直径/mm大肠杆菌四联球菌枯草杆菌金黄色葡萄球菌空白对照0000提取液样品10.239.588.939.97药物对照9.524.535.344.67

表4 最小抑菌质量浓度试验结果

注：-为没长菌；+为少量长菌；++为适度长菌；+++为大量长菌。

3 结论

通过对乌梅中有机酸提取工艺方法进行的探索，最后采用有机酸得率最高、耗时最短且操作简单的超声波提取法提取有机酸。通过正交试验确定乌梅有机酸提取方法的最佳条件：提取溶剂为95%乙醇(体积分数)、料液比(g/mL)为1∶ 25、提取时间60 min以及超声频率100 kHz。验证实验结果显示：乌梅中有机酸的最佳得率为12.17%，该方法高效、快速。抑菌试验显示：乌梅有机酸提取液对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和四联球菌均有明显的抑制作用，最小抑菌质量浓度分别为15.625、15.625、31.25和31.25 mg/mL。

本研究表明乌梅有机酸具备优良的抗菌活性，其作为植物提取物活性成分可用于抑菌防腐，且具有天然性、无污染等优点，具备开发成为天然植物源性抗菌添加剂的潜力。

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