促红细胞生成素经超声微泡介导治疗大鼠损伤面神经的研究*

苏俊波，骆文龙，郝亚宁，王德平，刘 进

（重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010）

面神经是支配面部表情肌的混合神经，若受损易致面瘫，损伤后的修复是多学科合作的重要研究领域。近年来，学者们逐渐认识到神经生长微环境的重要性，并发现了多种神经营养因子，其中促红细胞生成素(EPO)主要由肾脏合成，有促进红细胞生成作用[1]。EPO及其受体在神经系统广泛分布，具有抗凋亡、抗炎、促进神经营养因子释放和神经再生等作用[2]。但EPO在人体内降解较快，全身给药神经营养效果不佳。微泡造影剂利用超声波与微泡造影剂相互作用所产生的生物学效应，可实现靶向治疗。本研究中运用超声靶向微泡(UTMD)介导EPO基因治疗大鼠面神经损伤，观察治疗后EPO基因mRNA转录水平及治疗效果，为研究和评价超声靶向微泡介导的面神经基因转染提供可靠依据。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 仪器、试药与动物

仪器：超声转染仪，BL－6420C型生物信号采集与处理系统及脂质微泡（白色冻干粉末状）由重庆医科大学附属第二医院超声影像学研究所提供。

试药：EPO液由重庆医科大学附属第二医院肝病研究治疗中心提供，PT－PCR引物，Trizol试剂由武汉谷歌生物科技有限公司提供。

实验动物：清洁级成年健康SD大鼠（雌雄不限），40只，体质量 220～230 g，许可证号为 SCXK（渝）2012－0001，由重庆医科大学动物实验中心提供，遵循实验动物伦理学原则进行处置。

1．2 方法

1．2．1 质粒提取

EPO液经大肠杆菌扩增16 h后，提取纯化，经酶切电泳鉴定，紫外分光光度计测定质量浓度为1 g／L。

1．2．2 脂质微泡与EPO基因的结合

脂质微泡中加入2 mL生理盐水混合摇匀，微泡直径 3～5 μm，浓度 0．5×108～1．0×108／mL。加入含 EPO基因溶液（质粒质量浓度为 1 g ／L）0．5 mL，混匀，室温下静置30 min，使基因充分黏附，检测混合液中质粒量浓度为 0．2 g ／L。

1．2．3 动物模型制作

采用5%戊巴比妥30 mg／kg腹腔内注射麻醉大鼠，局部注射5%利多卡因追加麻醉；在手术显微镜下切开大鼠右侧颞骨骨泡，用磨砖磨去面神经镫骨肌支骨管约3 mm，蚊式钳钳夹面神经干长约2 mm，力量为三扣，持续60 s，松开30 s，再钳夹60 s，手术显微镜观察，面神经损伤程度为束膜性神经中断，符合Sunderland损伤Ⅳ度[3]，缝合皮肤。各大鼠术后混合饲养。

1．2．4 动物分组及给药

应用随机数字表法将面神经损伤大鼠分为4组，每组10只。A组：EPO＋超声组，经股静脉插管注入含EPO 0．2 mg基因溶液1 mL，并使用超声转染仪紧贴大鼠面神经受损部位体外照射，功率0．75 W／cm2，频率1 MHz，照射 10 s，间隔 10 s，共 2 min； B 组：EPO ＋ 微泡组，经股静脉注入载基因微泡溶液1 mL；C组：EPO＋超声＋微泡组，注入载基因微泡溶液1 mL，再用超声触发，参数同A组；D组：单纯手术组，输入1 mL PBS作为对照。

1．2．5 一般状况观察

于面神经损伤后第1，7，14，28天观察每组大鼠进食、活动、眼部闭合、鼻尖偏向、胡须摆动、局部皮肤肌肉情况。

1．2．6 神经电生理检测

面神经损伤后第28天，以10%水合氯醛麻醉大鼠并固定，将记录电极插入面神经支配的面颊肌，电极间距约为4～6 mm，深度为（4±1）mm。针灸针刺激电极分插至神经损伤处近中枢段和外周端肌肉，采用BL－6420C型生物信号采集与处理系统，以波宽1 ms的正方波刺激，频率60 Hz，电流从0 mA开始，至出现动作电位。测定面神经动作电位波幅、潜伏期及传导速度。

1．2．7 标本采集

面神经损伤大鼠模型经基因转染28 d后，以10%水合氯醛 3．5 mL／kg腹腔注射麻醉大鼠；采用升主动脉插管，剪开右心耳；快速灌注生理盐水300 mL，至右心耳流出血液完全变清；立即用4%多聚甲醛PBS液，先快后慢灌注约250 mL，直至大鼠四肢僵硬。切取损伤处神经组织约1 mm。

1．2．8 损伤面神经组织中EPO基因mRNA转录的检测

采用PT－PCR法，引物由武汉谷歌生物科技有限公司提供，根据GenBank中登录的EPO基因合成。提取损伤处面神经组织RNA（Trizol试剂），以合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增（反应条件:94℃、30 s，54 ℃ 、30 s，72 ℃ 、40 s，共 35 个循环）。mRNA 水平用β－actin作为内标，以扩增倍数＝2－△△CT表示基因相对表达量。

1．3 统计学处理

采用SPSS 19．0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多个样本均数间两两比较行 q检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 大鼠一般状况

各组大鼠术后无死亡，切口无感染。面神经损伤后第1天，每组大鼠均出现饮食降低，活动范围缩小。损伤侧胡须倒伏、无摆动，鼻尖左偏，无闭眼；转染后第7天，各组大鼠胡须摆动情况较第1天无好转，组间无显著差别；损伤后第14天，A组、B组、D组大鼠仍无明显变化，C组大鼠术侧有少量胡须可观察到细微摆动，鼻尖仍向左偏，有上睑细微运动；术后第28天，A组、B组、D组大鼠术侧胡须较前有明显恢复，A组大鼠胡须部分向前竖起，但摆动无力，鼻尖稍偏左，右眼闭合不完全，C组大鼠术侧胡须可见有力的节律性摆动，鼻尖基本居中，右眼可闭合，肌肉萎缩较其余组大鼠程度轻。

2．2 神经电生理检测指标

C组大鼠面神经动作电位波幅和面神经传导速度高于A组、B组、D组，潜伏期低于其余3组(P＜0．05)。详见表1。

表1 各组大鼠转染后第28天损伤面神经电生理检测指标比较(±s，n＝10)

表1 各组大鼠转染后第28天损伤面神经电生理检测指标比较(±s，n＝10)

组别A组B组C组D组面神经传导速度（m ／s)14．8 ± 0．3 14．0 ± 0．2 17．8 ± 0．3 13．9 ± 0．4潜伏期（ms)8．8 ± 0．2 9．7 ± 0．3 7．9 ± 0．5 10．6 ± 0．3面神经动作电位波幅(μV)7．6 ± 0．4 5．6 ± 0．5 11．0 ± 0．8 5．4 ± 0．6

2．3 大鼠损伤处神经组织中EPO mRNA转录水平

C组大鼠面神经损伤处EPO mRNA表达量明显高于 A 组、B 组、D 组（P ＜0．05）。详见图 1。

3 讨论

图1 大鼠损伤处神经组织中EPO基因mRNA转录水平

面神经从桥脑发出，经过内听道及岩骨中狭长的骨性管道－面神经管，通过茎乳孔出颅腔，在这之间的任何部位受到损伤，皆可导致部分性或完全性面瘫。目前，面神经损伤的治疗多强调手术修复，但手术治疗存在风险，手术的适应证及获益仍不明确。研究发现，面神经损伤后的功能修复需要神经元胞体的存活和轴突的延伸。远端面肌来源的神经营养因子向神经元胞体逆行性运输发生障碍，使损伤局部神经营养因子缺乏，导致轴突再生的微环境遭到破坏[4]。此外，损伤细胞凋亡机制参与了面神经元的变性和死亡[5]。

EPO已被证实是一种新型的神经保护因子[6]，其与EPO受体结合后，使JAK2发生自体磷酸化，通过激活磷脂酰肌醇3，进一步激活 STAT－5。活化的 JAK2激活Bcl－2相关的细胞死亡促进蛋白等底物，发挥抑制凋亡作用；同时，活化的STAT－5移至细胞核，刺激线粒体内抗凋亡蛋白的释放，并通过抑制与细胞色素C释放有关的基因活性，减少凋亡发生[7]。

Viviani等[8]发现，EPO能诱导脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，而BDNF在神经保护作用中也具有重要地位。另外，EPO能增加星型胶质细胞释放β－神经生长因子（β－NGF）促进神经元生长。在坐骨神经损伤的动物试验中发现，EPO组损伤处雪旺氏细胞数量较对照组明显增加，体外试验则发现，EPO通过激活JAK2机制，刺激雪旺细胞增殖[9]。在自身免疫性脑脊髓炎动物模型中，EPO可增强少突胶质细胞的增殖和促进髓鞘的再生。本研究中，C组大鼠的面神经功能恢复较A组、B组、D组好，术侧胡须摆动、右眼闭合情况及鼻尖位置及均优于A组、B组、D组；神经电生理方面，C组大鼠的面神经动作电位波幅、面神经传导速度及潜伏期也明显优于A组、B组、D组，进一步证实了EPO的神经营养作用。

EPO有促进红细胞生成的作用，全身用药将会引起血液黏稠、血栓形成，甚至产生抗EPO抗体，出现纯红细胞再生障碍性贫血。超声微泡作为载体不但可在体循环中减少药品不良反应，提高病变区域的药物浓度，还可保护基因片段不被清除和降解[10]。同时，超声微泡作为一种非病毒载体，具有转染效率高、制备简易、无免疫原性等优势[11]。本研究中C组大鼠面神经损伤处EPO基因mRNA的表达量也显著高于A组、B组、D组。说明超声微泡造影剂能与目的基因有效结合，将目的基因转染靶组织，为修复受损面神经提供了安全、高效的途径。

综上所述，超声微泡介导EPO对受损面神经具有修复作用，为面神经的生物学治疗提供了新方法。

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