晚期结直肠癌患者血浆cf DNA中 K－RAS突变及与西妥昔单抗耐药的关系研究*

林 琳，庞雄昊，梁文丽，李美香

(广东省深圳市第二人民医院肿瘤科，广东 深圳 518037)

晚期结直肠癌是种异质性很大的疾病，肿瘤细胞遗传的多样性和肿瘤细胞抗原表达的易变性[1]为临床诊治带来很多挑战。临床 K－RAS基因检测的开展，为患者个体化治疗迈出重要一步。多项临床研究证实，对于K－RAS野生型晚期结直肠癌患者，化学治疗联合西妥昔单抗治疗有效率、无疾病进展时间和总生存时间均得到明显改善，但西妥昔单抗治疗最终会出现进展[2]。目前预测西妥昔单抗治疗耐药的指标不多，Musella等[3]研究发现，循环肿瘤细胞的数目可以作为 RAS－BRAF野生型晚期结直肠癌的预后指标，并可预测西妥昔单抗治疗的失败。cfDNA来源于肿瘤细胞的坏死或凋亡，半衰期数小时，能实时反映体内肿瘤状态，并携带肿瘤特异性基因改变，检测手段相对成熟。Morgan等[4]研究发现，相对于病理组织检测 K－RAS突变，通过 PCR kit技术检测晚期结直肠癌患者血浆中携带 K－RAS突变的cfDNA水平，发现敏感性和特异性为31%和97%，可作为组织活检的补充。Thierry等[5]通过定量PCR技术检测晚期结直肠癌患者外周血中携带 K－RAS突变的cfDNA水平与组织学中 K－RAS突变情况，发现cfDNA的敏感性和特异性为92%和98%。因此，通过检测晚期结直肠癌患者外周血血浆携带 K－RAS突变的cfDNA水平在临床是可行的。为揭示检测结直肠癌患者血浆cfDNA的 K－RAS突变情况和活组织检测的差异，确定结直肠癌患者血浆cfDNA中的 K－RAS突变情况与西妥昔单抗治疗效果的关系，解决临床以影像学为主导的药物治疗疗效和耐药判定问题，本研究中探讨了动态检测患者外周血血浆中携带 K－RAS突变的cfDNA与患者预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料

纳入标准：经CT检查证实可测量的病灶；经病理组织学确诊，组织病理学检测结果为第Ⅳ期mCRC；氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗失败；体能状态评分（ECOG）为0～2分；各器官功能不存在明显缺陷；本研究经我院医学伦理委员会批准,所有患者签署知情同意书。

病例选择：选择医院2015年6月至2017年6月收治的经组织病理学确诊的晚期结直肠癌患者100例，男67例，女 33例；年龄 62～78岁，平均（69．48±7．76）岁；结肠癌44例，直肠癌56例；肝脏转移26例，肺转移22例，盆腔转移19例，纵隔淋巴结转移18例，骨转移15例。

1．2 方法

给药方案：西妥昔单抗注射液（Merck KGaA，进口药品注册证号 S20130004，规格每瓶为20 mL∶100 mg）静脉滴注120 min，随后每周250 mg／m2持续静脉滴注60 min，2 个月后改为 500 mg／m2，每 2 周 1 次，与化学治疗同时进行。给药前30 min常规给予组胺受体拮抗剂盐酸异丙嗪注射液（广东南国药业有限公司，国药准字H44022504，规格为每支 2 mL∶50 mg）25 mg 肌肉注射，地塞米松磷酸钠注射液（国药集团容生制药有限公司，国药准字号 H41020036，规格为每支5 mg∶1 mL）5 mg静脉注射，使用西妥昔单抗时行心电监测。西妥昔单抗使用60 min后联合细胞毒药物。

FOLFIRI方案：盐酸伊立替康注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20061276，规格为每支5 mL∶100 mg）180 mg／m2，静脉滴注 30 ～90 min；亚叶酸钙注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20020177，规格为每支 5 mL ∶50 mg）200 mg／m2，静脉滴注 2 h，第 1～2 天；5－氟尿嘧啶（5－FU，西南药业股份有限公司，国药准字 H50020128，规格为每支 10 mL ∶0．25 g）400 mg／m2，静脉注射，第1天，联合5－FU 2 400 mg／m2，持续静脉泵入46 h，14 d为1个周期。所有患者使用化疗方案＋表皮生长因子受体(EGFR)单抗治疗。治疗前后，检测患者血液和穿刺组织中样本的 K－RAS突变状态，K－RAS突变型患者使用标准化方案，野生型患者使用西妥昔单抗首次 400 mg／m2持续。RECIST 版本 1．1和 NCI－CTCAE版本4．0用于检查研究中的终点。

血液收集：通过外周血液抽吸,将7．5 mL全静脉血收集在EDTA管（美国BD生物公司）中,保持于4℃冰箱直到分离，在收集后1 h内进行。将全血离心10 min（4℃，820 g），并将血浆级分转移至2 mL冷试管（德国艾本得生物有限公司）中，再次离心 10 min（4 ℃，20 000 g），并在新鲜的2 mL管中回收纯血浆，于－80℃下立即储存，直到cfDNA提取。

DNA提取：根据说明书，使用 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德国凯杰生物有限公司）从血浆中提取循环的无细胞DNA。取2 mL血浆进行cfDNA提取，并在50 μL洗脱缓冲液中回收cfDNA，4℃保存。

cfDNA定量：通过使用Qubit 2．0荧光计（美国赛默飞世尔有限公司）的荧光测量法确定cfDNA的总量。通过QIAamp循环核酸试剂盒获得的2 μL DNA洗脱液，并根据说明书使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒（美国赛默飞世尔有限公司）测定浓度。

K－RAS突变检测和定量:为了鉴定 K－RAS突变，回顾了FFPE肿瘤样品的HE染色载玻片，选择肿瘤组织进行分析。通过微观解剖去除来自2个未染色、5 μm厚组织切片的相应组织，并通过在TEN缓冲液（1 mmoL EDTA，10 mmoL TRIS － HCl，0．1 moL NaCl，pH 8．0）中孵育将组织裂解，包括蛋白酶K（20 g／L）过夜，62℃。将所得裂解物用于PCR反应，以扩增编码 K－RAS外显子 2(密码子 12／13)，外显子 3(密码子 59和 61)，以及 K－RAS的外显子4（密码子117和146）的区域基因。将 3 μL 裂解液加入 47 μL PCR 反应中，包括 25 μL PCR Master Mix S（美国赛默飞世尔有限公司），0．5 μL特异性 PCR引物混合物（每个引物25 pmol）和21．5 μL Millipore H2O。循环条件为，95℃ 5 min；2× [95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s]；2× [95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s]；2× [95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s]；35× [95℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s]；72 ℃ 10 min。在 1% 琼脂糖凝胶上分离PCR反应的一部分，以确保 K－RAS区域的成功扩增。不同 K－RAS的突变状态通过使用PyroMark Q24型测序仪（德国凯杰生物有限公司）的热测序确定密码子。根据QIAGEN的pyro－sequencing试剂的使用说明进行热解测序。所有引物的序列可根据要求提供。

1．3 统计学处理

应用Graph Pad Prism 7版本分析。除非另有说明，连续变量的结果以平均值±中值绝对偏差或平均值±标准误差表示，行Student′s t检验或 Mann－Whitney U检验；分类变量的比较行Fisher精确检验生存曲线行Mantel－Cox对数秩检验；相关分析由Pearson或Spearman相关分析进行。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 治疗前后 K－RAS突变丰度对比

首先，在转移性CRC的初步诊断中，应用了 K－RAS基因热点区域的ARMS－PCR检测cfDNA和肿瘤组织中 K－RAS突变情况。评估了外显子2（密码子12／13）、外显子3（密码子 59和61）和外显子 4（密码子 117和146）的 K－ RAS状态，并鉴定了 82．50%（33／40），其中cfDNA和组织中均检测出的 K－RAS突变的一致性为62．50%。使用来自相应患者的 cfDNA的 ARMS－PCR技术对数据进行补充，结果见表1。可见，cfDNA可作为无法取到组织样本时的一种可行的检测方法。

表1 治疗前后cfDNA的突变丰度比较(，%)

表1 治疗前后cfDNA的突变丰度比较(，%)

时间治疗前治疗后t值P cfDNA 17．00 ± 12．05 8．10 ± 7．98 9．287＜ 0．000 1肿瘤组织26．40 ± 9．80 12．60 ± 2．55 11．486＜ 0．000 1

2．2 K－RAS状态与西妥昔单抗耐药间的关系分析

1例患者中，原发肿瘤组织是 K－RAS外显子2－4的野生型，同时cfDNA分析也证实了 K－RAS表达为野生型，给予患者FOLFIRI＋西妥昔单抗进行治疗，见图1 A。在疾病进展后，检测到 K－RAS呈现突变状态，且相较于传统的血清学和影像学检测，cfDNA的检测更方便、准确，可实时动态监控患者的疾病状态。另1例患者，肿瘤组织也被确定为 K－RAS外显子2－4的野生型，但cfDNA检测到的 K－RAS 3号外显子突变，即是Q61H，由于组织分析是当时 K－RAS评估的标准，患者接受了FOLFIRI＋帕尼单抗（患者自行购买）治疗。结果显示，K－RAS突变在治疗开始后1个月，cfDNA中并没有 K－RAS突变，可能是由于采用细胞毒剂（伊立替康）治疗。约5个月后（即放射学确认的疾病进展前超过2个月），cfDNA中再次检测到相同的突变，详见图1 B。结果表明，与单次cfDNA定量相比，基于cfDNA的 K－RAS筛查在治疗期间早期检测疾病进展有潜在价值，EGFR单抗治疗中 K－RAS的突变状态是导致耐药的重要因素。

2．3 K－RAS状态与预后的关系

根据cfDNA中基因表达水平进行患者的生存分析已被用于多类型的癌症，汇总分析证实，cfDNA中 K－RAS水平升高的总生存期(OS)缩短。在肿瘤中肿瘤体积和肿瘤中cfDNA的含量存在正相关关系。详见图2A。K－RAS的突变丰度在无疾病生存期（PFS）中有着显著差异（P＝0．047），见图2B。K－RAS野生型患者和 K－RAS突变型患者OS也存在显著差异，野生型患者中位OS为10．2个月（8．3～11．7）个月，突变型患者的中位 OS 为 5．2 个月（4．6 ～5．9）个月（HR＝1．78，P ＝0．000 6），详见图 2 C。故cfDNA中 K－RAS的状态和患者预后存在明显的相关性。

3 讨论

图1 K－RAS状态与西妥昔单抗耐药的关系

图2 K－RAS状态与预后的关系

随着手术治疗、化学治疗、放射治疗等综合治疗手段的进步，早期结直肠癌患者的预后得到明显改善，但仍有50%～60%的结直肠癌患者确诊时已伴远处转移。化疗药物及生物靶向药物的临床应用，晚期结直肠癌患者OS延长至30多个月以上，且提高了生活质量[6]。

研究表明，患者待检测样品中可分离并分析特定的基因和肿瘤的关系[7]。cfDNA于1948年首次被描述，已作为潜在的癌症患者体征的说明[8－10]。对于动态cfDNA分析，集中在临床相关的2个时间点，即治疗前和治疗后，可通过成像确定。本研究中，治疗前cfDNA中 K－RAS的突变丰度呈明显变化，治疗前后组织中 K－RAS突变丰度明显高于cfDNA中 K－RAS，组织中肿瘤细胞的含量更高，外周血中肿瘤细胞的含量相对低于肿瘤组织，故检测结果中存在细微差异。一致性方面，cfDNA和肿瘤组织中同时检测的 K－RAS突变比例达62．50%，这与以往研究数据[11－12]一致。因此，结直肠癌患者治疗过程中行K－RAS定量对肿瘤采取无创治疗方法具有指导意义。

K－RAS基因的突变对于结直肠癌患者后续治疗方案的选择有重要意义。有研究显示，K－RAS位于EGFR基因下游，对于 K－RAS基因突变的患者，EGFR单抗类药物获益程度不大[13]。本研究中，在EGFR野生型患者，K－RAS治疗前突变为0，但随着治疗的深入，K－RAS基因的突变丰度增加，特别是在再次发生疾病进展时突变丰度明显升高；同时，cfDNA的检测方法相较于传统的影像学和血清学的检测更方便，且可检出突变的时间略微提前。目前，许多研究集中在 K－RAS的发生和突变的复发 K－RAS抗下等位基因EGFR治疗[14－16]。但目前临床仍不清楚该如何处理这些结果。关于组织cfDNA之间发生 K－RAS突变时如何选择，本研究结果显示，K－RAS突变确实可在化疗加抗EGFR抗体的组合下消失，且在疾病进展时被再次检测出。因此，在某些情况下，明显的联合化疗也能抑制结直肠癌中的 K－RAS突变。

基因突变与患者的无疾病生存率及总生存率存在一定的关系。本研究结果显示，K－RAS突变的患者总生存率明显低于 K－RAS野生型患者，且无疾病生存率也展现出类似结果，故对于肿瘤患者热点基因的检测就显得至关重要。晚期结直肠癌患者 K－RAS的状态和临床用药及预后存在明显的相关性。

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