新型纳米级超声微泡的特性及其在疾病治疗中的潜在作用

刘旭东 王萍 马苏亚

超声微泡是临床上常用的疾病诊断对比剂。然而，常规超声微泡的循环时间短和粒径大的缺点严重限制了其有效渗入病变组织的能力。新近研究发现粒径在700nm内的纳米级超声微泡可以在超声诱导膜通透性升高的基础上快速通过血管内皮，并在靶部位聚集[1]。目前，新型纳米级超声微泡在疾病治疗中的作用是研究的热点之一。本文就新型纳米级超声微泡的特性及其在疾病治疗中的潜在作用作一综述。

1 超声微泡

超声除了具有方向性好、穿透能力强和声能集中等特点外，还能依靠与生物组织间的各种效应（机械效应、热效应和空化效应）从而介导载药或基因的超声微泡进行靶向治疗[2]。

苏俊波等[3]研究了超声微泡介导碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在受损面神经修复中的可行性及有效性。他们构建了大鼠模型，然后通过股静脉注入载bFGF的超声微泡。结果发现，与对照组相比，超声辐照介导携带bFGF超声微泡组中bFGF mRNA和蛋白表达量显著升高；并且大鼠面神经电生理表现及一般状况明显优于对照组。由此可见，超声辐照联合超声微泡可明显提高基因的转染率，有助于面神经损伤的修复。孙佳星等[4]研究了低频超声联合载顺铂超声微泡对比剂对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。他们在体外培养了人卵巢癌OVCAR-3细胞，并随机分为对照组、超声组、顺铂组、超声联合顺铂组和超声联合顺铂与超声微泡组。结果发现，超声联合顺铂与超声微泡组对细胞的增殖抑制作用及促凋亡作用显著强于其他处理组及对照组，其抑制细胞增殖的机制与顺铂诱导肿瘤细胞发生凋亡有关。这些实验说明，超声微泡在超声的介导下促进基因和药物进入细胞内，进而发挥治疗的作用。

超声微泡作为药物和基因递送系统的主要缺点是它们相对较大的粒径（1～10μm），这是限制超声微泡递送药物和基因穿透血管上皮到达目标组织的主要问题。在静脉注射超声微泡时，超声微泡进入并被限制在血液循环中，因此，载药/基因超声微泡的应用主要局限于心血管和肿瘤血管内皮的靶向中[5]，而粒径在700nm内的纳米级超声微泡可以快速通过血管内皮，从而进入靶组织。因此，纳米级超声微泡在临床治疗方面具备更强的优势，已成为超声微泡研究方向的热点之一。

2 纳米级超声微泡

2.1 特性及其与药物或基因的连接方式 纳米级超声微泡是指以高分子聚合物、脂质体或白蛋白为外壳，分子大小在1nm～1μm之间的内含气体超声微泡[6]。其特性有：（1）可通过毛细血管壁和细胞膜壁来递送药物，从而减少机体的不良反应并增强治疗的效果[7]。（2）可通过增强的渗透和滞留效应从而聚集在靶向组织内，提高靶组织内的药物浓度[8]。（3）用配体修饰的纳米级超声微泡可以黏附到靶向组织上，从而促进药物在细胞内的摄取。（4）作为靶向递送载体，纳米级超声微泡可以在受到声波作用时释放其外壳上或内部的药物或基因，从而减少对正常组织的损伤。

纳米级超声微泡携带药物或基因的方式主要有[9]：（1）将药物或基因与纳米级超声微泡的表面外壳或其构件连接起来。张淼[10]制备了携载靶向雄激素受体小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）的纳米级超声微泡，利用多聚赖氨酸法将siRNA通过静电吸附在纳米级超声微泡的表面，并在荧光显微镜下观察发现：纳米级超声微泡与雄激素受体siRNA紧密结合；粒径检测仪测量平均粒径为（608.2±13.3）nm，Zeta电位为（-29.9±6.5）mV。与常规超声微泡对比剂相比，这种纳米级超声微泡体内显影时间显著延长（P＜0.05），肿瘤中心乏血管区域显影效果较好，为下一步利用超声辐照微泡破坏，释放siRNA到肿瘤组织间隙当中，进而提高其对肿瘤细胞的治疗效果提供了研究基础。（2）将药物或基因封装在纳米级超声微泡气体或液体核心中。葛建丽等[11]制备了载紫杉醇的聚乳酸-卵磷脂纳米级超声微泡，通过冷冻干燥技术以及改良的超声复乳-溶剂挥发法，将紫杉醇包裹在纳米级超声微泡核心中。借助透射电镜可以观察到这种纳米级超声微泡的大小均匀，互不粘连；所有纳米级超声微泡表面光滑，外观圆整。通过激光衍射粒度分析仪测定显示，纳米级超声微泡粒径为（60.5±4.6）nm，粒径大小波动在 30～110nm。通过这种方法制得的紫杉醇纳米级超声微泡的载药量和包封率也分别达到了19.8%和87.8%，可以更好地应用于疾病的治疗。（3）将药物或基因封装进纳米级超声微泡后再连接到微米级超声微泡的表面。

2.2 制作方法 纳米级超声微泡的制备过程复杂。通常先采用薄膜水化法[12]、模板法[13]、冷冻干燥法[14]、机械振荡法[14]和乳化法[15]等方法制备得到壳核结构的纳米级超声微泡，然后通过静电吸附法、共价结合法、生物素-亲和素连接法和硫醇-马来酰亚胺化学法[16]等连接方式在纳米级超声微泡表面连接上靶向物质。

王平等[17]制备了可稳定显像的新型小粒径纳米级超声微泡比对剂，并评价了其在体内外的超声显像效果。研究者首先通过薄膜-水化、声振-通气及多级分离等步骤制备了纳米级脂质微泡，针对制备过程中的主要影响因素设计了正交试验，筛选出所构纳米级超声微泡粒径小和重复性好的实验条件；然后通过光学显微镜和Zeta粒径仪检测了纳米级超声微泡的大小形态和粒径分布；最后在动物体内通过超声显像检测了其增强显像的效果。结果发现，这种纳米级超声微泡呈圆形，分布均匀且无明显聚集，粒径范围为238.6～340.7（276.0±24.1）nm，Zeta电位为（-14.0±0.6）mV。体外超声检测显示，纳米级超声微泡在超声造影状态下能持续稳定显像，进入到二维灰阶状态时，纳米级超声微泡瞬间被破坏，显像效果消失。体内超声显像显示，在造影状态下纳米级超声微泡可明显增强大鼠肝脏和肾脏的回声信号。他们的实验表明这种新型纳米级超声对比剂在超声辐照下的良好特性，为进一步的肿瘤组织血管外靶向及肿瘤局部药物释放研究奠定了基础。

Xie等[18]制备了可靶向诊断早期肝脏缺血再灌注损伤的脂质纳米级超声微泡，并在体内外定量评价了这种脂质纳泡超声造影的显影效果、稳定性及造影参数的可靠性。研究者应用薄膜水化和超声振荡法制备普通的脂质纳米级超声微泡，并通过生物素-亲和素连接法，将生物素化的细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）抗体靶向连接于生物素化的脂质纳泡上，制备出绿色荧光标记的载ICAM-1抗体的靶向脂质纳泡；然后通过透射电镜、MAlvern纳米激光粒度仪和激光共聚焦显微镜检测了纳米级超声微泡的大小形态、粒径分布及其在体外与靶细胞的结合情况；最后在动物模型内评估了这种靶向脂质纳米级超声微泡的显影效果。结果显示靶向脂质纳米级超声微泡粒径约（148.15±39.75）nm，Zeta电位（-28.4±7.9）mV，浓度（3.6～7.4）×109个/ml，与抗体结合率高达95.7%；激光共聚焦显微镜下观察发现脂质纳米级超声微泡的绿色荧光较好地黏附在人肝窦内皮细胞表面。动物体内超声造影显示，靶向脂质纳米级超声微泡峰值强度及增强持续时间明显高于普通纳米级超声微泡，达峰时间明显提前。他们的实验证实了这种纳米级超声微泡的稳定性和靶向性，为将来研究靶向药物传递及携带基因治疗提供了良好的实验基础。

3 纳米级超声微泡的应用

由于纳米级超声微泡独有的特性，越来越多的文献表明其在疾病治疗中具有显著性作用，现从以下几个方面进行论述。

3.1 在肿瘤中的应用 许多实体肿瘤的血管内皮细胞间隙约380～780nm，大于正常的血管内皮细胞间隙，增强的高通透性和滞留效应允许纳米级超声微泡通过这些肿瘤的毛细血管，并聚集在实体肿瘤组织内[19]。在此基础上，超声介导纳米级超声微泡作为载体进行靶向治疗可进一步增加药物和基因的递送效率，推动了其在血管外领域的拓展，尤其在肿瘤的治疗中具有较好的应用前景。

Suzuki等[20]制备了一种新型的脂质体纳米级超声微泡。为了研究这种纳米级超声微泡和超声联合治疗癌症的可行性，他们将Colon-26细胞接种到BALB/c小鼠腹侧以皮下成瘤，并在高强度超声辐照下在小鼠体内进行了试验。结果发现，与对照组相比，超声介导的脂质体纳米级超声微泡组中小鼠体内结肠癌细胞的生长受到了显著抑制。进一步研究表明，超声介导的纳米级超声微泡可通过空化效应激活体内的免疫系统（尤其是CD8+T细胞）从而抑制肿瘤的生长。他们的实验结果说明了超声介导的空载纳米级超声微泡在抑制肿瘤细胞生长中的作用。

Yin等[21]开发了由共聚物和脂质构成的纳米级超声微泡，以研究其在肿瘤靶向治疗中的作用，在投射电子显微镜下发现这些微泡的大小为250～500nm，其在超声辐照下可稳定存在约50min。为了研究这种纳米级超声微泡在肿瘤中的作用，Yin等[21]将靶向抗凋亡基因sirtuin-2的siRNA与纳米级超声微泡混合后，通过尾静脉注射进神经胶质瘤裸鼠模型中。结果表明，与对照组相比，超声辐照下载siRNA纳米级超声微泡组中神经胶质瘤细胞的生长显著减缓；肿瘤的体积明显小于其他组。实验结果表明了载基因纳米级超声微泡在肿瘤的治疗中具有巨大潜力。

Rapoport等[22]制备了内载有紫杉醇的全氟化碳纳米乳剂，将其注射到模型小鼠体内观察研究了这种纳米乳剂在肿瘤中的作用。结果显示与对照组相比，1MHz超声可增强纳米乳剂在肿瘤中的聚积，并可显著诱导胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌模型中肿瘤的消退。深入研究其机制发现，在超声作用下，纳米乳剂可在局部转化为纳米级超声微泡，从而减少了载体外壳的厚度，并通过超声介导的空化效应增加肿瘤细胞对内载药物的摄取。实验结果为载药纳米级超声微泡在肿瘤治疗中的应用提供了新的思路。

3.2 在神经系统中的应用 脊髓损伤会导致患者严重残疾或死亡，通常的治疗选择包括手术干预、药物治疗和干细胞移植。然而，这些方法的周期较长且效率较低，它们恢复脊髓功能的效果也并不能令人满意。因此，寻找新的治疗方法是目前的研究热点。Song等[23]为了研究超声介导载神经生长因子的纳米级超声微泡对于脊髓损伤的作用，构建了大鼠脊髓损伤的模型，并通过尾静脉注射了载神经生长因子的纳米级超声微泡。结果显示与对照组相比，通过超声辐照的载神经生长因子纳米级超声微泡能显著增加神经生长因子在脊髓损伤处的表达，并且减少了该位置的组织损伤，损伤处神经元的丢失与凋亡也明显减少。研究结果证实了超声介导纳米级超声微泡在脊髓损伤中的治疗作用优于单独使用药物或干细胞进行治疗。

甲氨喋呤（MTX）鞘内注射是目前治疗中枢神经系统白血病的一种常用方法，但因其为有创操作且需重复进行，使患者常常难以接受身体和心理上的损害。改变给药途径是亟待解决的问题。Vykhodtseva等[24]首次发现超声波能开放血脑屏障，开创了利用超声技术穿颅骨治疗的新领域。王翔等[25]研究了超声联合耦连载MTX纳米级超声微泡在促药物跨血脑屏障转运中的作用，他们开发了一种载MTX的纳米级超声微泡，并在大鼠体内注射了这种微泡。结果显示与对照组相比，超声辐照下的载MTX的纳米级超声微泡在大鼠脑组织中明显浓聚。进一步实验表明，血脑屏障结构的基础脑微血管内皮细胞在超声结合微泡辐照后依旧保持完整，可能的机制是纳米级超声微泡在超声的作用下产生了空化作用，从而引起血脑屏障的开放。实验结果为中枢神经系统疾病的治疗提供了一种安全无创的新方法。

此外，席晓平等[26]也对新近研究进行系统分析后发现，载药纳米级超声微泡通过空化效应可改变细胞膜的通透性、增加细胞间隙、提高药物通过血脑屏障的效率，进而达到有效治疗的目的，将成为中枢神经系统白血病一种有效的治疗方案。

3.3 其他应用 Tiukinhoy等[27]用携带阿奇霉素的纳米级超声微泡治疗感染有肺炎衣原体的人脐静脉血管内皮细胞模型。结果表明，与对照组相比，超声辐照纳米级超声微泡组中细菌的增生受到了显著抑制。由此可见，超声介导纳米级超声微泡在抗炎治疗中也有明显作用。

由于纳米级超声微泡具有粒径小、生物可溶性好和循环时间长的特点，在诊断与治疗相结合理念的指导下，Becker等[28]研究了二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）/胆固醇、DPPC/硬脂酸聚乙二醇（PEG40S）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）/PEG40S及声诺维等材料的纳米级超声微泡在人血凝块中的超声增强溶栓效果。结果表明，这些新型超声纳米微泡在超声作用下可以表现出良好的溶栓效果；同时，体外实验发现在诊断性超声频率如1.4MHz的超声波作用1h后，血凝块重量可明显减轻，且DSPC/PEG40S微泡组效果更明显。该研究表明超声介导的纳米级超声微泡也有可能实现对栓塞小动脉的再通，其中超声辐照起关键作用。

4 局限性与展望

目前，纳米级超声微泡的治疗作用已在细胞水平和动物模型中进行了广泛的研究，并取得了一定的进展。超声介导的纳米级超声微泡治疗是一种非侵入性、易于接受的技术，其不仅将侵袭力最小化，还具有高度的可重复性。此外，纳米级超声微泡可以利用超声的优点（增加血管和细胞的通透性）来促进药物和基因的转运，增强纳米级超声微泡在病变组织中的积聚，从而增加治疗效果并减少不良反应。例如，在肿瘤的治疗中，携载药物的纳米级超声微泡可以通过肿瘤的EPR效应更好地聚集在肿瘤组织内，提高肿瘤组织内的药物浓度；在此基础上，纳米级超声微泡可以连接特异性抗体来进行肿瘤的靶向治疗，从而减少所载药物对正常细胞的损害与杀伤。这样不仅增加了药物的使用效率，而且降低了患者的治疗费用，从生理和心理上减轻了患者的负担。

然而，仍有许多问题和困难阻碍着纳米级超声微泡在临床中的应用，主要有以下3点：（1）需改进纳米级超声微泡的生产方法，简化繁琐的构建过程；（2）纳米级超声微泡的药物和基因装载率还应提高，并且需要更高效的特异性靶向递送能力；（3）超声可以增加细胞膜的渗透性，而相对较高的纳米级超声微泡浓度和较高的超声强度可能导致周围正常细胞和组织的损伤，因此适宜的纳米级超声微泡浓度和超声使用参数需要被进一步探索。

随着分子生物学、纳米技术和超声医学等学科的不断发展，纳米级超声微泡必将在临床治疗中拥有更加广阔的前景。