不同香型大曲酯化酶的特性分析

邢爽，魏志阳，郭学武，王亚平，谌柄旭，李秋志,2，肖冬光

（1.工业微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）（2.河北山庄老酒股份有限公司，河北承德 067500）

酯类物质是白酒中所占比例最大的香味物质，其中主要包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯，称为四大酯类[1]。清香型白酒以乙酸乙酯和乳酸乙酯为主体香；浓香型白酒以己酸乙酯为主体香，与乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等一起构成复合香气；酱香型白酒香味成分最为复杂，酯类物质分布较广[2～4]。这些酯类物质形成与白酒发酵过程中所用的大曲有很大关系，白酒风格的形成与所用大曲也息息相关。

大曲是糖化发酵剂，“曲是酒之骨，好曲出好酒”，因此大曲在白酒酿造过程中起着非常重要的作用[5～7]。大曲一般采用小麦、大麦和豌豆等原料，经粉碎拌水后压制成砖块状的曲坯，人工控制一定的温度和湿度，让自然界中的各种微生物在上面生长而制成[8,9]。清香型大曲以大麦和豌豆为原料，制曲温度不超过50 ℃，是中温曲的典型代表。酱香型大曲采用纯小麦为原料，制曲温度高，品温最高可达65～68 ℃。浓香型大曲制曲原料各酒厂情况不一，主要以小麦为主，最高品温介于酱香型酒曲和清香型酒曲之间，大多控制在55 ℃左右[10～12]。大曲中含有丰富的酿酒微生物菌系和酶系，其中酶系包括糖化酶、淀粉酶、蛋白酶和酯化酶等，大曲酯化酶可催化酸和醇生成相应的酯类物质[13]。不同香型大曲由于制曲原料、制曲环境和制曲工艺的差异，所网罗的微生物菌系不同，导致酯化酶的催化特性也有所不同。

本文主要研究白酒三大香型大曲-清香型大曲、浓香型大曲和酱香型大曲酯化酶的活力与催化特性，探讨不同酸浓度和pH值下不同香型大曲催化合成乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯的规律，为白酒生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓香型大曲，清香型大曲，酱香型大曲：某大曲生产厂提供；乙酸、乳酸、己酸、丁酸、乙醇：分析纯，天津市北方天医化学试剂厂；氢氧化钠、硫酸：分析纯，天津市津科精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

SeverEasy型pH计：瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；Agilent 7890B气相色谱仪：美国安捷伦科技公司；DHP恒温培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酸浓度对三种香型大曲酯化酶活力的影响

采用250 mL螺口试剂瓶，以体积分数为20%的乙醇溶液作为溶剂，加大曲粉5 g，按表1配制不同乙酸、乳酸、丁酸和己酸浓度的反应液，pH自然，反应液总体积100 mL。以不加曲粉的反应体系为对照组，且将对照组的pH与实验组pH调成一致。30 ℃静置反应7 d后，测定相应的酯含量。

表1 不同酸浓度反应液的配制Table 1 The preparation of reaction fluid with different acid concentration

1.3.2 pH对三种香型大曲酯化酶活力的影响

反应体系及条件同 1.3.1，在保持各酸浓度不变（根据白酒生产时的实际情况，乙酸和乳酸浓度取25 g/L、己酸和丁酸浓度取8 g/L）情况下，用NaOH和H2SO4溶液调节反应液pH分别为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0。

1.4 酯化酶活力的测定

1.4.1 酯含量的测定

将反应完毕的试样倒入500 mL蒸馏瓶中，用100 mL蒸馏水洗涤试剂瓶且一并倒入蒸馏瓶中，进行蒸馏，接取100 mL蒸馏液，用注射器取1～2 mL蒸馏液过膜添加到气相色谱瓶中，采用气相色谱外标法检测，色谱仪为 Agilent7890B，色谱柱采用 Agilent HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），载气为高纯氮气（＞99.999%）；柱流速为0.8 mL/min；进样口温度200 ℃；检测器温度150 ℃；程序升温：起始温度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；进样体积为1 μL；分流进样，分流比为10:1[14]。

1.4.2 酯化酶活力计算

对照组中酯的形成由酸醇的化学反应而来；实验组添加了大曲粉，乙醇体积分数为20%，曲中的微生物被抑制，不发挥作用[15]，因此实验组中酯的形成是酯化酶催化和化学合成两方面作用的结果；酯化酶催化产酯量即为实验组酯含量与对照组酯含量的差值。酯化酶活力为一定条件下每g曲7天内催化合成相应酯的量（mg），以mg/g表示，计算公式如下：

式中，A：酯化酶活力，mg/g；c1：实验组酯含量，mg/L；c2：对照组酯含量，mg/L；V：反应液体积，0.1 L；w：曲粉质量，5 g。

1.5 数据统计与分析

每个实验指标做三个平行试验，将测定的实验数据利用Excel 2010进行运算处理，结果以“平均值±标准差”表示，并采用Origin 8.5软件对结果数据进行绘图分析。

2 结果与讨论

2.1 酸浓度对三种香型大曲酯化酶活力的影响

在本研究体系中乙醇是过量的，在此前提下研究酸浓度对大曲酯化酶催化的影响。按照1.3.1的方法，在不同酸浓度下进行了大曲酯化酶的催化反应，结果如图1至图4。

2.1.1 乙酸浓度对大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影响

图1 乙酸浓度对大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影响Fig.1 Effect of acetic acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl acetate

乙酸浓度对三种香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力的影响见图 1。从结果看，三种香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力：清香型大曲＞浓香型大曲＞酱香型大曲；随着乙酸浓度的升高，三种香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力均是先升高后降低的趋势，其中清香型和浓香型大曲催化合成乙酸乙酯的最适乙酸浓度为25 g/L，而酱香型大曲为15 g/L。在最适酸浓度下，清香型、浓香型、酱香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力分别为43.95 mg/g、20.72 mg/g、6.02 mg/g。

2.1.2 乳酸浓度对大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影响

图2为三种香型大曲催化合成乳酸乙酯酶活力随乳酸浓度变化的趋势。从结果看，随着乳酸浓度的升高，三种香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力均呈下降趋势；乳酸浓度为5 g/L时其酯化酶活力最高，清香型、浓香型和酱香型大曲的酯化酶活力分别为1.75 mg/g、1.87 mg/g、0.98 mg/g；乳酸浓度为30 g/L时，三种香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力均为负值，此时大曲酯化酶表现为分解作用。

图2 乳酸浓度对大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影响Fig.2 Effect of lactic acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl lactate

2.1.3 己酸浓度对大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影响

图3 己酸浓度对大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影响Fig.3 Effect of caproic acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl caproate

图3为三种香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力随己酸浓度变化的曲线。从结果看，三种香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力：浓香型大曲较强，清香型大曲与酱香型大曲活力相当。随着己酸浓度的增加，三种香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力先升高后降低，其中清香型大曲催化合成己酸乙酯的最适己酸浓度为5 g/L，而浓香型和酱香型大曲为8 g/L。在最适己酸浓度下，清香型、浓香型、酱香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力分别为4.39 mg/g、5.29 mg/g、4.53 mg/g。

2.1.4 丁酸浓度对大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影响

丁酸浓度对三种香型大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影响如图4所示。从结果看，随着丁酸浓度的升高，三种香型大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力变化趋势有所不同，清香型和浓香型大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力先升高后降低，而酱香型大曲的酶活力逐渐升高；其中清香型大曲催化合成丁酸乙酯最适丁酸浓度为10 g/L，浓香型大曲为15 g/L，而酱香型大曲在丁酸浓度为20 g/L时催化合成丁酸乙酯酶活力最高。

图4 丁酸浓度对大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影响Fig.4 Effect of butyric acid on the enzyme activity of Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl butyrate

2.2 pH对大曲酯化酶活力的影响

pH对酶的活性以及稳定性影响很大，pH过高或过低，会影响酶蛋白的稳定性，使酶遭受不可逆破坏，导致酶蛋白失活而变性，其次影响酶活性中心上必须基团的解离状态，使其与底物不能结合，从而影响底物与酶的催化活性[16]。不仅如此，过高或过低的 pH会造成酶活性中性改变，酯分解作用增强，酯类物质减少，因此酶对pH的要求比较严格。研究pH对大曲酯化酶的催化影响有助于掌握其催化规律，指导白酒生产。

2.2.1 pH对大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影响

图5 pH对三种香型大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影响Fig.5 Effect of pH on the enzyme activity of different flavorDaqu in catalyzing and synthesizing ethyl acetate

图5为pH对三种香型大曲催化合成乙酸乙酯酶活力的影响。从结果看，随着pH的升高，三种香型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力均是先升高后降低，且均在pH为4.0时活力达到最大值，此时清香型、浓香型和酱香型大曲酯化酶活力分别为 44.22 mg/g、31.52 mg/g、13.06 mg/g。在pH较低或接近中性时三种大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力都较低，其中浓香型大曲在pH 2.0和7.0时、酱香型大曲在pH≥6.0时，酯化酶活力为负值，表现为分解作用。

2.2.2 pH对大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影响

图6 pH对三种香型大曲催化合成乳酸乙酯酶活力的影响Fig.6 Effect of pH on the enzyme activity of different flavor Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl lactate

三种香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力随 pH变化的曲线如图6所示。由图可看出，随着pH的升高，三种香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力先升高后降低，其中清香型和浓香型大曲最适pH均为7.0，而酱香型大曲为8.0。在最适pH下，清香型、浓香型和酱香型大曲酯化酶活力分别为 17.42 mg/g、10.49 mg/g、3.38 mg/g。在pH较低时三种大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力都较低，其中浓香型大曲在 pH≤2.0时、清香型和酱香型大曲在 pH≤3.0时，酯化酶活力为负值，表现为分解作用。

2.2.3 pH对大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影响

图7 pH对三种香型大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影响Fig.7 Effect of pH on the enzyme activity of different flavor Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl caproate

pH对三种香型大曲催化合成己酸乙酯酶活力的影响如图7所示。从其变化曲线可以看出，随着pH的升高，三种香型大曲催化合成己酸乙酯的酶活力均是先升后降，清香型、浓香型和酱香型大曲催化合成己酸乙酯最适的pH分别为5.0、4.0、4.5。在高于或低于最适pH时三种大曲催化合成己酸乙酯的酶活力迅速下降，其中浓香型和酱香型大曲在pH 2.0时，酯化酶活力为负值，表现为分解作用。

2.2.4 pH对大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影响

图8 pH对三种香型大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影响Fig.8 Effect of pH on the enzyme activity of different flavor Daqu in catalyzing and synthesizing ethyl butyrate

pH对三种香型大曲催化合成丁酸乙酯酶活力的影响如图8所示。从结果看，随着pH值的升高，三种香型大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力均是先升高后降低，清香型、浓香型、酱香型大曲催化合成丁酸乙酯的最适pH分别为4.5、4.0和3.0。低于最适pH时三种香型大曲的酶活力迅速下降，而高于最适pH时酶活力下降较为缓慢，在pH 2.0和7.0时，三种大曲催化合成丁酸乙酯的酶活力均为负值，表现为分解作用。

3 结论

不同香型大曲由于制曲工艺的差异，所网罗的微生物菌系不同，其酯化酶的催化特性也有所不同。

3.1 清香型大曲催化合成乙酸乙酯和丁酸乙酯的酶活力最大；浓香型大曲催化合成乳酸乙酯和己酸乙酯的酶活力最大；酱香曲催化合成酯类物质的酶活力最小。

3.2 一般情况下，较高的底物浓度有利于催化反应的进行，但对以酸为底物的酯反应而言，酸浓度的提高使反应体系的pH下降，而过低的pH影响酯化酶的活性，因此，随着酸浓度的升高大曲酯化酶活力表现为先升高后降低。通过调节高酸浓度下的pH值，可有效提高酯化反应的速度。

3.3 酯化反应是可逆反应，在一定条件下催化酯类物质的分解，反应液酯含量低于对照，大曲酯化酶活力为负值。本试验结果表明，催化合成乙酸乙酯时浓香型大曲在pH 2.0和7.0时、酱香型大曲在pH≥6.0时，酶活力为负值；催化合成乳酸乙酯时浓香型大曲在pH≤2.0时、清香型和酱香型大曲在pH≤3.0时，酶活力为负值；催化合成己酸乙酯时浓香型和酱香型大曲在pH 2.0时，酶活力为负值；催化合成丁酸乙酯时，三种大曲在pH 2.0和7.0时酶活力均为负值。上述情况的发生可能存在的原因是：1、特定的pH条件促进体系中酯类物质的分解作用；2、特定的pH条件抑制体系中乙醇与有机酸的合成作用。无论是哪种原因导致，上述结果均对白酒中酯类物质的生成是不利的。

3.4 本研究的结果表明，各种酯的合成都有其合适酸浓度和pH范围，如要考虑调节酯香物质的相对含量，可通过适当调节酒醅的酸度来实现。

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