一测多评法测定莲威阿纳其颗粒中5种成分的含量

曹智雅，耿东升

(新疆医科大学1药学院，乌鲁木齐　830011；2新疆军区药品仪器检验所，乌鲁木齐　830063)

一测多评法测定莲威阿纳其颗粒中5种成分的含量

曹智雅1，耿东升2

(新疆医科大学1药学院，乌鲁木齐830011；2新疆军区药品仪器检验所，乌鲁木齐830063)

摘要：目的莲威阿纳其颗粒中5种成分的一测多评含量测定方法的建立。方法采用高效液相色谱法，色谱柱Inertsil ODS-3(5 μm，4.6mm×250mm)，流速1.0mL/min，检测波长270 nm，柱温30℃，进样量10μL流动相为乙腈-0.3%磷酸水，流动相配比为0～15min，乙腈0%～10%；15～45min，乙腈10%～30%；45～60min，乙腈30%～75%；60～70min，乙腈75%～95%；70～80min，乙腈95%～0%。以绿原酸为内标建立与松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的相对校正因子，计算松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、绿原酸的含量，实现一测多评。同时采用外标测定10批莲威阿纳其颗粒中5种成分的含量，并比较相对校正因子所得计算值与实测值的差异，以验证一测多评法的准确性和可行性。结果莲威阿纳其颗粒中检测成分的相对校正因子分别为：f绿/f松=0.445 9，f绿/f芦=0.4530，f绿/f毛=0.590 5，f绿/f淫=0.812 2。一测多评法的计算值与外标法所得的实测值差异无统计学意义(P<0.05)。莲威阿纳其颗粒中5种成分的含量分别为绿原酸0.60mg/g、松果菊苷11.37mg/g、芦丁0.79mg/g、毛蕊花糖苷2.17mg/g、淫羊藿苷 0.77mg/g。结论一测多评法操作简便，结果稳定可靠，可作为莲威阿纳其颗粒的定量分析方法。

关键词：莲威阿纳其颗粒；含量测定；一测多评法；相对校正因子

中图分类号：R914

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-0619-06

当下，珠航局正在全力构造珠江水运的“四梁八柱”，通过建设“干支衔接区域成网的高等级航道体系、江海联动功能互补的港口服务体系、功能完善优质高效的现代航运体系、生态优先示范带动的绿色发展体系、职责清晰保障有力的安全预控体系、协调有力运转有效的水运治理体系”6大体系，推动珠江水运实现“一流的设施、一流的技术、一流的管理、一流的服务”发展目标，为交通强国建设助力。

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.022

基金项目：新疆维吾尔自治区科技支疆项目(201191257)

作者简介：曹智雅(1993-)，女，在读硕士，研究方向：药物分析。

通信作者：耿东升，男，硕士，主任药师，硕士生导师，研究方向：药品监督与药理学，E-mail：dongsheng811@sina.com。

本文引用：曹智雅，耿东升.一测多评法测定莲威阿纳其颗粒中5种成分的含量[J].新疆医科大学学报,2018,41(5):619-624.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.022

SimultaneousdeterminationoffivecomponentsinLianweianaqigranulesbyquantitativeanalysismulti-componentssinglemarker

CAOZhiya1，GENGDongsheng2

(1SchoolofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2InstituteforDrugandInstrumentControlofXinjiangMilitaryCommand,Urumqi830063,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for Simultaneous determination of five components of Lianweianaqi granules.MethodsThe relative correction factors(RCF)of echinacoside,rutin,acteoside and icariin were established by high performance liquid chromatography with chlorogenic acid as internal standard.The chromatographic conditions are Chromatographic column Inertsil ODS-3(5 μm,4.6mm×250mm),1 ml/minflow rate,270 nm detection wavelength,30℃column temperature,mobile phase is acetonitrile -0.3% phosphoric acid water,flow matching ratio is 0-15min,0%-10% acetonitrile;15-45min,10%-30% acetonitrile;45-60min,30%-75% acetonitrile;60-70min,75%-95% acetonitrile;70-80min,95%-0% acetonitrile.The RCF was used to calculate the content of echinacoside,rutin,acteoside,icariin and chlorogenic acid,to achieve quantitative analysis multi-components single marker(QAMS).At the same time,the external reference method was used to determine the amounts of the five components in the powder of 10 batches of Lianweianaqi granules,to compare the difference between the calculated and real data of the two method,and to validate the correctness and adaptability of QAMS.ResultsThe RCF for the detectable components in the granules were:f绿/f松=0.445 9，f绿/f芦=0.4530，f绿/f毛=0.590 5，f绿/f淫=0.812 2.There was no significant difference between the calculated and real data of the two method(P<0.05).The 5 components were chlorogenic acid 0.60mg/g,echinacoside 11.37mg/g,rutin 0.79mg/g,acutin 2.17mg/g and icariin 0.77mg/g.ConclusionThe QAMS is simple and reliable,and it can be used as the quantitative analysis method of the preparation.

Keywords:Lianweianaqi granules;determination of content;quantitative analysis multi-components single marker;relative correction factor

一测多评法(quantitative analysis multi-components single marker，QAMS)是利用中药有效成分之间的内在函数和比例关系，通过测定1个成分(对照品易于得到)实现对多个成分(对照品难得到或供应)的同步测定，是一种适合中药特点的多指标质量评价模式[1]。2015年版《中国药典》中已收录了多种中药及其制剂的一测多评方法[2]。莲威阿纳其颗粒由雪莲、肉苁蓉、桑椹、阿那其根、骨碎补、威灵仙、土鳖虫、仙灵脾、等12味中药组成，具有补肾通络、活血化瘀、祛风止痛等功效，临床上多用于治疗退行性关节炎[3]，方中以雪莲、肉苁蓉、桑椹合为君药，主要成分为芦丁、绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷等[4-7]；以阿那其根、骨碎补、鹿衔草、土鳖虫、仙灵脾合为臣药，主要成分为芦丁、绿原酸、淫羊藿苷等[8-10]。本研究以绿原酸为内标，采用一测多评法建立莲威阿纳其颗粒中绿原酸与松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的相对校正因子，以相对校正因子计算4种成分含量，并将一测多评法与外标法进行比较，确定一测多评法测定莲威阿纳其颗粒中有效成分的可靠性，现报道如下。

1　材料

1.1仪器Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，R-200D型电子天平(德国Sartorius公司)，AKHL-Ⅲ-16型艾柯超纯水机(四川成都康宁实验专用纯水设备厂)，KQ52B型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器股份有限公司)。

1.2试药芦丁(中国食品药品检定研究院，批号100080-201409，纯度92.6%)，绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号110753-201415，纯度96.2%)，松果菊苷(中国食品药品检定研究院，批号111670-201505，纯度92.5%)，毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院，批号111530-201309，纯度92.9%)，淫羊藿苷(中国食品药品检定研究院，批号110737-201516，纯度94.2%)，乙腈(美国SIGMA公司，色谱纯)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。10个批次的莲威阿纳其颗粒为新疆军区药品仪器检验所实验室自制。

2　方法与结果

2.1莲威阿纳其颗粒的制备将雪莲、肉苁蓉等5味药材经70%乙醇提取，干燥后得到的醇提浸膏干粉；将阿那其根、桑椹等药材经水提取干燥后所得的粗多糖干粉与经灭菌的骨碎补和土鳖虫细粉混匀，分别加入稀释剂和助悬剂(药粉重量10%的微晶纤维素细粉和0.5%羧甲基纤维素钠)，以70%乙醇为润湿剂制粒，60℃干燥整粒后再混入白术挥发油-β环糊精包合物细粉，制得符合药典规定的颗粒剂。

2.2溶液的制备方法

2.2.1对照品溶液的制备称取绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷标准品，用70%乙醇配置成浓度分别为6.12、101.60、6.92、33.60、16.16μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备称取莲威阿纳其颗粒0.1 g，置10mL容量瓶中，加入70%乙醇，超声提取30min，放至室温，定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性供试品溶液的制备按处方比例配置缺雪莲、肉苁蓉、雪莲、鹿衔草和仙灵脾的阴性颗粒，按“2.2.2”项下方法制备，即得阴性对照溶液。

2.3色谱条件Inertsil ODS-3色谱柱(5 μm，4.6mm×250mm)；流动相：乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，柱温30℃；检测波长270 nm；流速1.0mL/min，进样量10μL，洗脱程序见表1，见色谱图1～6。

表1　梯度洗脱程序

(1：绿原酸；2：松果菊苷；3：芦丁；4：毛蕊花糖苷；5：淫羊藿苷)

(1：绿原酸；2：松果菊苷；3：芦丁；4：毛蕊花糖苷；5：淫羊藿苷)

(1：绿原酸；2：松果菊苷；3：芦丁；4：毛蕊花糖苷；5：淫羊藿苷)

2.4方法学考察

2.4.1标准曲线的制备分别吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液1、2、5、10、15μL，按“2.3”项下色谱条件测定，以对照品的进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，各成分在浓度范围内线性关系良好，见表2。

表2　莲威阿纳其颗粒中5种成分标准曲线和范围

2.4.2精密度试验取同1份莲威阿纳其颗粒供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，测定绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面积，计算得 RSD分别为0.9%、1.4%、1.9%、1.9%、2.0%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3重复性试验取同一批号的莲威阿纳其颗粒0.1 g，平行6份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷化学成分的含量，RSD分别为1.0%、1.8%、1.6%、2.3%、1.5%，表明方法的重复性良好。

2.4.4稳定性试验取同1份莲威阿纳其颗粒供试品溶液10μL，按“2.3”项下色谱条件，分别于配置后的0、2、4、8、12、24h测定峰面积积分值，绿原酸、松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷内峰面积的RSD分别为1.2%、1.0%、1.8%、1.3%、1.3%，表明在24h内供试品溶液的稳定性良好。

2.4.5加样回收率试验取已知含量的同一批次样品约0.1 g，平行6份，加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，计算各成分的加样回收率及RSD，见表3。

表3　莲威阿纳其颗粒中5种成分加样回收率结果

2.5相对校正因子的确定

2.5.1相对校正因子的测定取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别进样1、2、5、10、15μL进行测定。选择绿原酸为内标物，根据相对校正因子的计算公式[11]：fk/m=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)其中AK为内标物峰面积，WK为内标物浓度为，Am为其他组分峰面积，Wm为其他组分浓度，分别计算内标物绿原酸与松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷之间的RCF，见表4。

2.5.2校正因子耐用性考察取“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样1、2、5、10、15μL测定，计算各成分相对校正因子，考察Agilent 1100、Shimadzu LC-20A 高效液相色谱仪，Inertsil ODS-3(5 μm，4.6mm×250mm)、XBridgeTMC18(5 μm，4.6mm×250mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6mm×250mm)，3种不同色谱柱对绿原酸相对校正因子的影响，结果RSD值均<5.0%，表明在不同高效液相色谱仪和色谱柱对RCF无影响，见表5。

表4　莲威阿纳其颗粒的相对校正因子

2.5.3待测组分色谱峰定位考察相对保留值(rk/s)、相对时间差(ΔtR(k))2种参数在2种不同仪器和3种不同色谱柱的重现性。各成分相对保留值按公式rk/s=tR(k)/tR(s)计算，其中tR(k)为指标成分的保留时间，tR(s)为内标的保留时间。各成分的相对时间差按公式ΔtR(k/s)=tR(k)-tR(s)计算，其中tR(k)为指标成分保留时间，tR(s)为内标的保留时间。结果各待测成分相对保留值RSD均小于5%，相对保留时间差RSD值均>6%，见表6。

表5　莲威阿纳其颗粒中5种成分相对校正因子耐用性的考察结果

表6　莲威阿纳其颗粒中5种成分的相对保留值和相对时间差测定结果

2.5.4一测多评法与外标法测定结果的比较分别采用一测多评法与外标法对10批莲威阿纳其颗粒中5种成分色谱峰进行定位并计算含量。为确定一测多评法的准确性，本实验利用2种方法进行考察：(1)相关系数考察法[12]：将2种方法结果经相关系数分析，二者之间的相关系数均>0.999 9，说明2种方法得到的含量相似性极高。将计算结果经t检验，P>0.05，说明2种方法得到的计算结果无差异。(2)相似度评价法[13]：借鉴指纹图谱相似度评价方法，通过计算夹角余弦值来评价外标法与一测多评法所得结果的相似度，从而考察两者的差异程度。根据夹角余弦的统计学定义，2组数据的夹角余弦值越接近1，其两者差异越小，相似度越高。将2种方法得到的数据计算夹角余弦值，结果均在0.989～0.999，表明其相似度极高。可见一测多评法在莲威阿纳其颗粒的质量评价中应用是可行的，见表7。

表7　一测多评法与外标法对莲威阿纳其颗粒中5种成分测定结果/(mg/g，n=10)

注：A：外标法；B：一测多评法。

3　讨论

3.1样品处理方法的优化为使颗粒中成分提取完全，本研究选用了不同浓度的甲醇、乙醇、水作为溶剂进行提取，并考察超声和回流2种提取方法的效果。结果颗粒中黄酮类成分和苯乙醇苷类成分均溶于乙醇，以70%乙醇超声法提取，所得图谱分离度较好，杂质峰较少，方法简单，成本较低。

3.2色谱条件的优化绿原酸为苯丙素类化合物，分子结构中含脂键、不饱和双键及多元酚3个不稳定结构，其分子结构中邻二酚羟基极易被氧化，受热、见光都能使其丧失生物活性，而在酸性环境中更稳定；同时其他成分中也含有酚羟基呈弱酸性，酸性缓冲体系可改善含弱酸性酚羟基类的分离效果和峰型[14-15]。本研究考察了甲醇-水、乙腈-水，加入甲酸、磷酸、乙酸等流动相系统，结果乙腈-0.3%磷酸水流动相系统的分离效果最优，分离度、理论塔板数、出峰数目、出峰时间均达到满意结果。

[收稿日期：2017-09-16]

(本文编辑施洋)