石榴花多酚对离体大鼠胸主动脉环舒张作用的影响

孙秀超，买尔旦·玉苏甫，张　健，鲁彦坤，潘　佳，努尔威亚·努尔买买提，陶威熔，赛义德·谢卜利·艾哈迈德，魏媛媛

(新疆医科大学1基础医学院药理学教研室;2第一临床医学院；3国际教育学院；4基础医学院生理学教研室,乌鲁木齐　830011)

·基础医学研究·

石榴花多酚对离体大鼠胸主动脉环舒张作用的影响

孙秀超1，买尔旦·玉苏甫1，张健2，鲁彦坤2，潘佳2，努尔威亚·努尔买买提2，陶威熔2，赛义德·谢卜利·艾哈迈德3，魏媛媛4

(新疆医科大学1基础医学院药理学教研室;2第一临床医学院；3国际教育学院；4基础医学院生理学教研室,乌鲁木齐830011)

摘要:目的研究石榴花多酚(Pomegranate Flower Polyphenol，PFP)对离体大鼠胸主动脉环舒缩功能的影响及作用机制。方法采用离体血管环灌流法观察(100～900)mg/L PFP对大鼠胸主动脉环张力的影响，给予钾通道阻断剂和一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，测定大鼠血管组织中所含一氧化氮的含量。结果当PFP浓度为(700～900)mg/L时，与内皮去除组比较，内皮完整组PFP对大鼠胸主动脉环舒张作用更强，差异有统计学意义(P<0.01)。钾通道阻断剂格列本脲(Glib，10 μmol/L)、四乙基氯化铵(TEA，3mmol/L)、氯化钡(BaCl2，100 μmol/L)预处理均能抑制PFP对内皮去除大鼠胸主动脉环的舒张效应。PFP对无钙高钾液中Ca2+收缩曲线和无钙液中PE引起的内钙释放均有抑制作用。一氧化氮合酶抑制剂L-NAME预处理对PFP诱导的内皮完整大鼠胸主动脉环舒张作用具有抑制作用。结论石榴花多酚具有内皮依赖性和内皮非依赖性2种舒张血管作用。

关键词：石榴花多酚；血管舒张；一氧化氮；钾钙通道；血管环

中图分类号：R965

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-585-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.015

基金项目：国家自然科学基金(81360669)

作者简介：孙秀超(1990-)，男，在读硕士，研究方向：植物药药理。

通信作者：魏媛媛，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向:植物药药理，E-mail：wei8923270@sina.com。

本文引用：孙秀超，买尔旦·玉苏甫，张健,等.石榴花多酚对离体大鼠胸主动脉环舒张作用的影响[J].新疆医科大学学报,2018,41(5):585-589.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.015

Diastoliceffectofpomegranateflowerpolyphenolonisolatedratthoracicaorticrings

SUNXiuchao1,MaierdanYusufu1,ZHANGJian2,LUYankun2,PANJia2,NuerweiyaNuermaimaiti2,TAOWeirong2,SyedShibliAhmed3,WEIYuanyuan4

(1DepartmentofPharmacology,SchoolofPre-clinicalMedicine,2the1stSchoolofClinicalMedicine,3InternationalEducationInstitute,4DepartmentofPhysiology,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate diastolic effect of Pomegranate Flower Polyphenol(PFP)on isolated rat thoracic aortic rings and its mechanism.MethodsThe tension of isolated thoracic aortic rings of rats in presence or absence of PFP(100～900mg/L)were observed by vascular ring perfusion method in vitro,then the mechanism were explored by application of Ca2+&K+channel blockers and nitric oxide synthase inhibitor L-NAME.And the content of nitric oxide in rat vascular tissue was determined.ResultsWhen the concentration of PFP was(700～900)mg/L,PFP in the intact endothelium group had a stronger effect on rat thoracic aortic rings dilation than that in the group with endothelial deprivation(P<0.01).Diastolic effect on denuded rat thoracic aortic rings induced by PFP could be inhibited by pretreatment of K+channel blockers:10 μmol/L Glib,3mmol/L TEA and 100 μmol/L BaCl2.PFP could move the calcium-constriction curve to the right in calcium-free high-potassium solution,and inhibit intracellular calcium releasing induced by PE in calcium-free solution.Pretreatment with nitric oxide synthase inhibitor L-NAME inhibited relaxation of thoracic aortic rings with intact endothelium induced by PFP.ConclusionPFP has endothelium-dependent and endothelium-independent vasodilation effects.

Keywords:Pomegranate flower polyphenols;vasodilation;nitric oxide;potassium/calcium channel;vessel ring

石榴花为石榴科(Punicaceae)石榴属(PunicL.)植物石榴(PunicgranatumL.)的干燥花瓣,富含安石榴苷、石榴鞣质、鞣花酸、原花青素和没食子酸乙酯等多酚类物质[1]，具有良好的抗氧化及抗炎活性，临床上多用于治疗鼻衄、腹泻、恶心呕吐等多种疾病[2]。本课题组前期研究显示石榴花多酚(PFP)具有降糖调脂抗氧化等功效[3-4]，通过测定血管活性物质发现PFP可以有效降低糖尿病大鼠血浆中缩血管活性物质内皮素-1(ET-1)、血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)浓度、抗血栓素B2(TXB2)和6酮前列腺素1a(6-Keto-PGF1a)比值，提示PFP具有一定保护血管内皮功能作用[5-6]。石榴鞣质和原花青素还能够抑制高糖引发的血管内皮损伤[7-8]。本研究采用离体大鼠胸主动脉环模型探究石榴花多酚对离体大鼠胸主动脉舒张作用的影响，并分析其作用机制，现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器BL-420F型生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，HV-4型恒温离体组织器官灌流系统(成都泰盟科技有限公司),X205BDU型电子天平(瑞士梅特勒仪器有限公司)，Research Plus型微量移液器(德国艾本德仪器有限公司)。

1.2试药乙酰胆碱(美国Sigma公司，批号BCBR3675V)，去氧肾上腺素(阿拉丁试剂有限公司，批号H1420012)，格列本脲(美国Sigma公司，批号SLBC7951V)，N-硝基-L-精氨酸甲酯(美国Sigma公司，批号WXBC2777V)，格列本脲用二甲基亚砜溶解，其他试剂均用超纯水溶解。96T一氧化氮试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号AK0017NOV20016)。其他化学试剂均为分析纯。Kreb-Henseleit(K-H)液的成分为：NaCl 118mmol/L,NaHCO325mmol/L,KCl 4.7mmol/L,KH2PO41.2mmol/L,MgCl21.2mmol/L,glucose 2 g/L,CaCl22.5mmol/L,pH=7.4。

1.3药材石榴花采集于新疆和田地区，经中科院新疆生态与地理研究所植物分类研究室沈观冕研究员鉴定为石榴科植物石榴(PunicgranatumL.)的花。石榴花多酚由中科院新疆理化技术研究所提供。

1.4实验动物SPF级雄性SD大鼠体质量(270±20)g，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(新)2016-0003。

2　方法

2.1大鼠胸主动脉环模型的制备颈椎脱臼处死大鼠，快速将胸主动脉取出，放入4℃预冷的K-H液，清除血管周围的脂肪和结缔组织后，剪成3mm的胸主动脉环备用。在胸主动脉环内壁用牙签来回滚动去除内皮细胞为内皮去除组，未去除内皮细胞为内皮完整组。将胸主动脉环置于37℃恒温K-H液中，连接HV-4型恒温离体组织器官灌流系统张力换能器，持续通入95%O2和5%CO2的混合气体，用BL-420F生物机能实验系统记录胸主动脉环张力。1.0 g前负荷下平衡1 h,每15min换K-H液1次。平衡后加入KCl至60mmol/L，以达到最大张力，并以此检查胸主动脉环的活性。用微量移液器加去氧肾上腺素(Phenylephrine,PE)至1 μmol/L预收缩胸主动脉环后，加入10 μmol/L的乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)使胸主动脉环舒张，当舒张率达到80%以上认为内皮完整，当ACh几乎不能舒张血管时判定为内皮去除。

2.2内皮对PFP舒张血管作用的影响取12个内皮完整胸主动脉环，随机分为2组(内皮完整对照组和内皮完整PFP组)，取12个内皮去除胸主动脉环，随机分为2组(内皮去除对照组和内皮去除PFP组)，每组6个胸主动脉环。各组胸主动脉环按“2.1”项下方法平衡后，用1 μmol/L的PE 溶液将胸主动脉环预收缩至再次平衡，内皮完整PFP组和内皮去除PFP组依次累积加入 PFP(100、300、500、700、900mg/L)，每隔3min加1次药。内皮完整对照组和内皮去除对照组加入等量K-H液，用BL-420F生物机能实验系统测定胸主动脉环张力。胸主动脉环舒张率用加入PFP后胸主动脉环舒张幅度与PE引发的最大收缩幅度之间的比值来表示，制作浓度舒张曲线。

2.3钾通道阻断剂对PFP舒张血管作用的影响取24个内皮去除胸主动脉环，随机分为4组(内皮去除PFP组、内皮去除Glib组、内皮去除TEA组和内皮去除BaCl2组)，每组6个胸主动脉环。内皮去除Glib组、内皮去除TEA组和内皮去除BaCl2组胸主动脉环按“2.1”项下方法平衡后，分别用ATP敏感性钾通道(ATP sensitive K+channels，KATP)阻断剂格列本脲(Glibenclamide,Glib)10 μmol/L、大电导钙激活性钾通道(large conductance calcium activate K+channels，BKCa)阻断剂四乙基氯化铵(Tetraethylammonium,TEA)3mmol/L、内向整流性钾通道( Inward rectifier K+channels，Kir)阻断剂氯化钡(BaCl2)100 μmol/L浸泡15min。用1 μmol/L的PE预收缩后，再依次累积加入PFP(100、300、500、700、900mg/L),每隔3min加1次药。用BL-420F生物机能实验系统测定胸主动脉环张力。胸主动脉环舒张率用加入PFP后胸主动脉环舒张幅度与PE引发的最大收缩幅度之间的比值来表示，制作浓度舒张曲线。

2.4PFP对无钙高钾K-H液中CaCl2量效曲线的影响取12个内皮去除胸主动脉环，随机分为2组(内皮去除对照组和内皮去除PFP组)，每组6个胸主动脉环。将内皮去除对照组胸主动脉环按“2.1” 项下方法平衡后，放入无钙高钾K-H液(含60mmol/L K+和100 μmol/L EGTA)预处理20min后，依次累积加入(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L)CaCl2，每隔3min加1次药，用BL-420F生物机能实验系统测定胸主动脉环张力，得钙离子收缩曲线。内皮去除PFP组为加入CaCl2前用789mg/L PFP预处理10min，其他处理方法同内皮去除对照组。

2.5PFP对胞质内钙释放诱导血管收缩的影响取12个内皮去除胸主动脉环，随机分为2组(内皮去除对照组和内皮去除PFP组)，每组6个胸主动脉环。将内皮去除对照组大鼠的胸主动脉环按“2.1” 项下方法平衡后，在无钙 K-H 液(含100 μmol/L EGTA)中平衡10min，加入PE至 1 μmol/L。内皮去除PFP组大鼠胸主动脉环用无钙K-H液孵育5min，用789mg/L的PFP孵育10min，加入PE 至1 μmol/L，用BL-420F生物机能实验系统测定PE引起的胸主动脉环张力，将内皮去除对照组和内皮去除PFP组张力作比较。

2.6L-NAME对PFP舒张血管的影响取12个内皮完整胸主动脉环，随机分为2组(内皮完整PFP组和内皮完整L-NAME组)，每组6个胸主动脉环。将各组大鼠的胸主动脉环按“2.1” 项下方法平衡后，将内皮完整L-NAME组大鼠的胸主动脉环用100 μmol/L的N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)浸泡30min，将内皮完整PFP组大鼠的胸主动脉环用K-H液浸泡30min，稳定后用1 μmol/L的PE收缩至平衡后，依次累积加入PFP(100、300、500、700、900mg/L)，每隔3min加1次药，用BL-420F生物机能实验系统测定胸主动脉环张力。胸主动脉环舒张率用加入PFP后胸主动脉环舒张幅度与PE引发的最大收缩幅度之间的比值来表示，制作浓度舒张曲线。

2.7Griess法测定血管组织中NO含量取24个内皮完整胸主动脉环，随机分为4组：(1)内皮完整对照组：将大鼠胸主动脉环放入K-H液中孵育6 h；(2)内皮完整高糖组：将大鼠胸主动脉环用D-葡萄糖(44mmol/L)的K-H液孵育6 h诱导血管内皮功能的损伤；(3)内皮完整PFP组：将大鼠胸主动脉环用PFP 10mg/L的K-H液孵育6 h；(4)内皮完整高糖+PFP组：将大鼠胸主动脉环用PFP(10mg/L)和D-葡萄糖(44mmol/L)的K-H液共同孵育6h。每组6个血管环。将各组大鼠胸主动脉环制成10%组织匀浆，4℃下2 000 r/min离心10min，吸取上清液，按96T一氧化氮试剂盒说明书测定大鼠胸主动脉的NO含量。

3　结果

3.1内皮对PFP舒张作用的影响与内皮去除PFP组相比，内皮完整PFP组大鼠胸主动脉环舒张作用更强，差异有统计学意义(P<0.01)。内皮完整PFP组和内皮去除PFP组大鼠胸主动脉环最大舒张效率Emax分别为(76.24±6.59)%和(46.38±7.36)%，内皮完整对照组和内皮去除对照组大鼠胸主动脉环最大舒张效率Emax分别为(27.53±6.38)%和(24.42±6.63)%，见图1。

3.2钾通道阻断剂对PFP舒张血管作用的影响与未经钾通道阻断剂处理的内皮去除PFP组大鼠胸主动脉环相比，用3种不同类型的钾通道阻断剂预处理的内皮去除胸主动脉环，PFP舒张胸主动脉环的作用减弱，差异有统计学意义(P<0.01)。内皮去除PFP组Emax为(47.55±5.17)%，内皮去除BaCl2组Emax为(10.17±4.70)%，内皮去除Glib组Emax为(14.20±5.32)%，内皮去除TEA组Emax为(2.43±7.32)%，见图2。

3.3PFP对CaCl2量效曲线的影响与内皮去除对照组比较，内皮去除PFP组最大收缩率减小，差异有统计学意义(P<0.01),内皮去除对照组与内皮去除PFP组最大收缩率分别为(46.40±4.13)%和(8.75±7.13)%，见图3。

(注：与内皮完整对照组比较，**P<0.01；与内皮去除对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与内皮去除PFP组比较，++P<0.01。)

3.4PFP对胞质内钙释放诱导血管收缩的影响与内皮去除对照组比较，内皮去除PFP组最大收缩率减小，差异有统计学意义(P<0.01)。内皮去除对照组与内皮去除PFP组大鼠胸主动脉环的最大收缩率分别为(65.22±8.15)%和(31.34±6.02)%，见图4。

3.5L-NAME对PFP舒张血管作用的影响与内皮完整PFP组比较，内皮完整L-NAME组大鼠胸主动脉环Emax减小，差异有统计学差异(P<0.01)。内皮完整PFP组Emax为(74.86±8.90)%，内皮完整L-NAME组Emax为(3.83±3.57)%，见图5。

3.6PFP对大鼠胸主动脉环中NO含量的影响与内皮完整对照组比较，内皮完整高糖组胸主动脉环中NO含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与内皮完整高糖组比较，内皮完整高糖+PFP组胸主动脉环中NO含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1　PFP和高糖对大鼠胸主动脉环中NO含量的影响

注：与内皮完整对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较,##P<0.01。

4　讨论

血管收缩主要基于细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)升高所诱发的血管平滑肌的收缩。因此影响[Ca2+]i的因素，均可影响血管收缩。内皮去除血管收缩主要依赖平滑肌上的钾通道和钙通道。钾通道的激活使K+外流，导致细胞膜超极化，使电压依赖性钙通道(voltage dependent calcium channels，VDCCs)的开放受到抑制从而拮抗血管收缩来舒张血管。本实验采用 ATP敏感钾通道(KATP)阻断剂Glib、钙激活钾通道(KCa)阻断剂TEA、内向整流钾通道(Kir)阻断剂BaCl2预处理后，均降低PFP对胸主动脉环的舒张作用，因此初步推测钾离子通道的激活与PFP对胸主动脉环的舒张作用有关。

血管平滑肌收缩所需要的Ca2+源于胞质内钙释放和细胞外流入。外钙内流途径主要通过VDCCs和受体操控性钙通道(receptor-operated calciumchannels，ROCCs)完成[9]。细胞外高浓度的K+可引起细胞膜去极化，激活VDCCs，VDCCs的打开导致Ca2+向细胞内流入，导致血管收缩[10]。在无钙高钾液中，PFP处理能够抑制CaCl2对胸主动脉环的收缩作用，推测PFP抑制了VDCCs的开放从而抑制Ca2+内流引起的血管收缩。PE与平滑肌上的α受体结合，经G蛋白-PLC-IP3信号途径引发平滑肌细胞肌浆网的Ca2+释放，还可通过ROCCs调节[Ca2+]i，进而增加血管张力。实验结果显示，PFP(789mg/L)可以拮抗无钙K-H液中PE诱导的胸主动脉环收缩，推测PFP舒张血管机制可能与PE诱导的内钙释放被抑制有关。

NO是内皮细胞产生的最重要的舒张血管因子，内皮细胞中NO经由内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化产生。本实验中大鼠胸主动脉环经一氧化氮合酶抑制剂L-NAME处理后，PFP的舒血管作用被阻断，表明NO参与PFP对胸主动脉环的舒张作用。高糖预处理的胸主动脉环NO含量降低，经PFP干预后，NO含量接近于对照组。高糖预处理可通过氧化应激破坏血管内皮功能，从而减少了NO的合成，这也是糖尿病血管并发症的病理基础之一。PFP增加了NO的生成，提示PFP舒张血管的作用与提高NO的生成有关。Berkban等[11]的研究发现鞣花酸能够增加血管组织中eNOS的合成，从而缓解高血压的发生。PFP 能够促进NO的生成可能亦与所含成分鞣花酸有一定的关系。

综上所述，PFP舒张血管的作用与促进NO合成，激活平滑肌上的钾通道以及抑制细胞外Ca2+内流和胞质内Ca2+释放有关。但其详细机制还有待进一步深入探讨。

[收稿日期：2018-01-26]

(本文编辑施洋)