金樱子提取物对小鼠结肠炎肠黏膜的保护作用

边　晨，刘　新，张　扬，邢　静，阿依古扎丽·热合曼，张坤坤，白　杰，代红燕

(新疆医科大学1临床医学2013-2班；2基础医学院药理学教研室；3本硕2014-4班；4基础医学院机能中心，乌鲁木齐　830011)

金樱子提取物对小鼠结肠炎肠黏膜的保护作用

边晨1，刘新2，张扬3，邢静1，阿依古扎丽·热合曼3，张坤坤1，白杰2，代红燕4

(新疆医科大学1临床医学2013-2班；2基础医学院药理学教研室；3本硕2014-4班；4基础医学院机能中心，乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨金樱子果实中总黄酮与多糖2,4,6 -三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的克罗恩病(CD)小鼠的黏膜保护作用。方法将140只KM小鼠分为空白对照组、模型组、5-氨基水杨酸(5-ASA)组、总黄酮高、低剂量组和多糖高、低剂量组，空白对照组正常饲养，其余各组小鼠利用TNBS建立CD模型，空白对照组给予等计量的蒸馏水，多糖高剂量组、低剂量组分别给予多糖6 g·kg-1·d-1、3 g·kg-1·d-1，总黄酮高剂量组、低剂量组分别给予黄酮4g·kg-1·d-1、2 g·kg-1·d-1，5-ASA组给予5-ASA 0.5 g·kg-1·d-1。每日1次，连续灌胃21d，处理动物。取小鼠结肠组织记录长度和重量，取固定结肠部位HE染色，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定结肠组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)含量。结果TNBS诱导的小鼠CD模型中，金樱子总黄酮和多糖可以降低小鼠结肠重量/长度比值、病理评分和结肠组织中TNF-α和IFN-γ表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)，但是各组间生存率差异无统计学意义。结论在该模型中金樱子果实提取物可以降低小鼠结肠重量/长度比值，改善结肠炎症水肿程度，降低结肠组织中TNF-α和IFN-γ含量,因此金樱子果实提取物对CD小鼠有一定治疗作用。

关键词：金樱子；克罗恩病；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；干扰素-γ(IFN-γ)

中图分类号：R965.2

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-0597-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.017

基金项目：国家大学生创新性试验计划项目(CX2016016)

作者简介：边晨(1994-)，男，在读本科，研究方向：肠道炎症与免疫。

通信作者：白杰，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：肠道炎症与免疫，E-mail:2250018725@qq.com。

通信作者：代红燕，女，硕士，高级实验师，研究方向：心血管及消化药理学，E-mail:414941636@qq.com。

本文引用：边晨，刘新，张扬,等.金樱子提取物对小鼠结肠炎肠黏膜的保护作用[J].新疆医科大学学报,2018,41(5):597-601.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.017

TheprotectiveeffectofRosalaevigataFructusextractontheintestinalmucosaofmicecolitis

BIANChen1，LIUXin2，ZHANGYang3，XINGJing1，AyiguzhaliRahman3，ZHANGKunkun1，BAIJie2，DAIHongyan4

(1ClinicalMedicineClass2013-2；2DepartmentofPharmacology，SchoolofPharmacy,3Combinedbachelor-masterDegreeProgramme2014-4，4FunctionalCenter,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoids and polysaccharides of Rosa Laevigata Fructus on the mucosal protection of crohn′s disease(CD)induced by TNBS.MethodsThe 140 KM mice were divided into no-treatment control group,model group,positive drug group,flavonoids high,low dose group and polysaccharide high and low dose group,using TNBS to established the CD model.By intragastric administration,then colonic tissue was collected after 21 days,the length and weight were measured,and the colonic area was collected for HE,and the contents of TNF-α and IFN-γ in the colon tissues were determined by ELISA.ResultsThere was significant difference in colon weight/length and content of TNF-α and IFN-γ between the model group and the no-treatment control group(P<0.05).However,there was no statistically significant difference in survival rate between the groups.ConclusionThis study showed the therapeutic effect of the extract of Rosa Laevigatae Fructus on CD mice.In this model,the extract of Rosa Laevigatae Fructus can reduce the ratio of colon weight/length in mice,and improve the degree of inflammation of the colon and decrease the content of TNF-α and IFN-γ in the colon tissues.

Keywords:Rosa Laevigata Fructus;crohn's disease;TNF-α;IFN-γ

克罗恩病( Crohn’s disease，CD)是一种病因不明的胃肠道进行性肉芽肿性疾病，从口腔至肛门的整个消化道均可受累，通常发生于回肠末端和邻近结肠，呈阶段性、跳跃性分布，临床主要表现为腹痛、腹泻、瘘管、肛门病变等。我国CD的发病率呈逐年升高趋势[1-2]。CD的发病机制尚不明确，目前认为主要与免疫异常有关[3]。现代医学对 CD的常规药物治疗主要包括5-氨基水杨酸制剂(5-ASA)、糖皮质激素、免疫抑制剂、抗肿瘤坏死因子(TNF)制剂、抗生素、益生菌等，由于常规药物在治疗有效性和安全性上存在局限性，近年来，如抗黏附分子、抗细胞因子、T细胞标记物等新型生物制剂逐渐成为研究重点，这些药物起效快，但也存在如价格昂贵、引发血液系统恶性病变等不足。中医药在本病的治疗方面有一定的疗效[4-5]。

金樱子作为常用中药，已有悠久的历史，早在《本草纲目》中就有记载金樱子“性酸、涩、平、无毒;主治脾泻下痢、止小便利、涩精气，久服，令人耐寒轻身，补血益精，有奇效”。近年来的研究表明金樱子具有抗氧化、抑菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、降糖降脂、保护肾脏等多种药理作用[6-8]。本研究以2,4,6 -三硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠结肠炎症建立克罗恩病模型，考察金樱子果实提取的总黄酮和多糖对小鼠结肠黏膜炎症的治疗作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物KM小鼠140只，体质量18～22 g，雌雄各半，由新疆医科大学动物实验中心提供，普通环境饲养。

1.2实验药材与试剂金樱子(新疆百草堂医药连锁公司提供)，TNBS(Sigma公司)，芦丁(S90103，北京索莱宝公司)，蒽酮(A7160，北京索莱宝公司)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)试剂盒(上海钰博生物科技有限公司)，苏木素染液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，伊红染液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，环保透明脱蜡液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，石蜡(莱卡公司，德国)，无水乙醇、浓硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝(均为国产分析纯)。

1.3实验仪器小型多功能提取浓缩回收机组(北京舜甫有限公司)，粉碎机(杭州旭众机械设备有限公司)，分光光度计(上海光学仪器五厂有限公司)，石蜡包埋机(莱卡Leica EG1150，德国)，切片机(莱卡RM2235，德国)，酶标仪(VarioSkan Flash，美国)，图像采集系统(莱卡三目显微镜DM3000B，德国)。

1.4实验方法

1.4.1总黄酮提取与浓度测定挑选金樱子完整干燥果实，用粉碎机粉碎，去除坚硬种子，整理和收集粉碎后部分。按照料液比1∶6加入40%乙醇，提取温度80℃，提取时间为5 h，进行总黄酮的提取[9]。利用旋转蒸发仪除去乙醇后，冷冻干燥，收集焦糖色物质，置于干燥处保存。准确称取芦丁标准品10.0mg置于25mL容量瓶中，加90%乙醇溶解，定容，准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL容量瓶中，加10%亚硝酸钠0.1mL 放置6min，再加5%硝酸铝0.5mL，放置6min加5%氢氧化钠4mL，补纯净水至刻度摇匀静置6min，以510 nm处测吸光度。依据吸光度和浓度计算标准曲线和R2，计算金樱子果实中40%醇提物总黄酮的含量。

1.4.2多糖提取与浓度测定挑选金樱子完整干燥果实，用粉碎机粉碎，去除坚硬种子，整理和收集粉碎后部分。按照料液比1∶4加入蒸馏水，提取温度90℃，提取时间为3h，对多糖进行提取，利用旋转蒸发仪除去部分水后，冷冻干燥，收集焦糖色物质，置于干燥处保存。依据《中国药典》采用硫酸-蒽酮法制作标准曲线，计算金樱子果实提取物中多糖含量。

1.4.3CD模型建立将小鼠随机分为空白对照组、模型组、5-ASA组、多糖高剂量组、多糖低剂量组、总黄酮高剂量组和总黄酮低剂量组，每组20只，雌雄各半。空白对照组不给予TNBS，正常饲养。其余各组小鼠剃毛后，于皮肤外涂抹TNBS 3.75mg(溶于48%乙醇)，于外涂TNBS 后的第7、14和21天时，各组小鼠直肠1.0～2.0cm处分别给予TNBS 0.75、1.5和2.25mg(溶于40%乙醇)，期间观察与正常对照组比较是否表现为腹泻、皮毛粗糙和活力减弱等现象，确认CD小鼠模型建立[10]。

1.4.4药物治疗对CD模型小鼠通过灌胃方式给药，每日1次，连续灌胃21d。正常对照组给予等计量的蒸馏水，多糖高剂量组、低剂量组分别给予多糖6 g·kg-1·d-1、3 g·kg-1·d-1[11]，总黄酮高剂量组、低剂量组分别给予黄酮4g·kg-1·d-1、2 g·kg-1·d-1，5-ASA组采用临床剂量，换算成小鼠用量为0.5 g·kg-1·d-1。

1.4.5动物观察与处理每日观察小鼠状态、粪便性状和称重并详细记录。处死后取出结肠组织称重后测量长度，在距离肛门5～10cm处剪取结肠组织。取1cm组织浸泡于10%福尔马林溶液中，固定36h后常规脱水，包埋。剩余组织放入冻存管中-80℃保存备用。包埋肠组织进行切片，HE染色制成病理切片，在显微镜下观察，拍摄照片并进行病理评分(CMDI)，评分标准如下：溃疡：分3级，0级：无；1级：小溃疡(直径<3mm);2级：大溃疡(直径>3mm)炎症：0级：无;1级：轻度;2级：重度。

1.4.6TNF-α和IFN-γ测定将冰冻结肠组织制成组织匀浆，离心取上清液，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测结肠组织匀浆上清液中TNF-α以及IFN-γ的表达水平，以其表达水平表征结肠组织炎症的程度，具体操作参照试剂盒说明书中的详细步骤。

2　结果

2.1多糖及总黄酮浓度根据硫酸-蒽酮法制作标准曲线后，测得金樱子果实提取物中多糖纯度为35.12%；根据芦丁标准品作标准曲线后，测得金樱子果实提取物中总黄酮纯度为2.79%。

2.2小鼠存活率记录给药期间各组小鼠的死亡只数，计算其终点生存率。模型组小鼠的终点生存率最低，与模型组比较，总黄酮提取物组、多糖提取物组和5-ASA组的小鼠存活率较高，但并无统计学差异。其中空白对照组由于灌胃操作原因导致小鼠当场死亡，其余各组无此类现象，见表1。

2.3结肠重量/长度比值与空白对照组比较，模型组小鼠结肠重量/长度比值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，金樱子总黄酮组、多糖组和5-ASA组小鼠结肠重量/长度比值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。金樱子总黄酮提物组、多糖提取物组和5-ASA组小鼠结肠重量/长度比值比较，无明显差异。提示金樱子总黄酮与多糖均能改善TNBS诱导的CD模型小鼠结肠组织的炎症水肿程度，见图1。

表1　给药后各组小鼠存活情况

2.4病理分析小鼠结肠组织切片HE病理分析结果表明，空白对照组小鼠结肠组织未见明显病变。模型组小鼠结肠组织病变明显，主要表现为上皮组织上皮细胞缺失、糜烂和浅溃疡形成，腺体密度降低，黏膜固有层有大量炎症细胞浸润，肌层增厚。金樱子总黄酮高剂量组、多糖高剂量组以及5-ASA组的小鼠结肠组织与空白对照组相似，无明显炎细胞浸润。金樱子总黄酮低剂量组和多糖低剂量组小鼠结肠组织可见少量炎细胞浸润，但无明显上皮细胞病变。采用结肠病灶病理组织显微镜检查并进行CMDI评分，模型组评分为(7.3±1.03)分，明显高于其他各组，见图2、图3。

2.5TNF-α和IFN-γ结果通过ELISA试剂盒测定小鼠结肠组织细胞因子TNF-α和IFN-γ结果显示，模型组TNF-α、IFN-γ水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，金樱子总黄酮提取物组、多糖提取物组和5-ASA组小鼠结肠TNF-α和IFN-γ水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。金樱子总黄酮提取物组、多糖提取物组和5-ASA组小鼠结肠组织中TNF-α和IFN-γ水平无统计学差异(P>0.05)，见图4、图5。提示金樱子总黄酮提取物与多糖提取物能有效降低TNBS诱导的CD模型小鼠结肠组织的炎症水平。

图2　各组小鼠结肠组织HE病理染色结果(100×)

3　讨论

研究结果显示，金樱子果实中总黄酮和多糖提取物虽然不能提高小鼠的存活率，但是，可以降低结肠重量/长度比值，改善结肠炎症水肿程度，同时可以降低TNF-α和IFN-γ的表达水平，改善结肠炎症水平，从而改善CD相关症状，与5-ASA相比具有一定治疗作用。

细胞因子与CD的发病密切相关，其中TNF-α和IFN-γ为重要的促炎因子和免疫调节因子，TNF-α在炎症反应过程中是出现最早和最重要的炎性介质，它能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节组织代谢活性并促进细胞因子的合成和释放。研究表明[12]，TNF-α和IFN-γ通过激活骨髓间充质干细胞(MSCs)导致目的检测核因子κB(NF-κB)/转录激活子3(STAT3)通路活化，24h预处理的MSCs通过尾静脉注射进入小鼠体内后，组织中的促炎因子IL-17、TNF-α、IL-1B、IFN-γ表达水平均明显增加。因此，通过降低TNF-α和IFN-γ的表达水平，可以降低肠道炎症水平以达到缓解病情的目的。

本研究结果表明，金樱子果实中总黄酮提取物与多糖提取物能有效降低TNBS诱导的CD模型小鼠结肠组织的TNF-α和IFN-γ含量，今后考虑进一步研究有关NF-κB和MAPK相关炎症通路，进一步阐述金樱子改善CD的作用机制。

[收稿日期：2017-11-05]

(本文编辑杨晨晨)