铁线蕨总黄酮对哮喘大鼠模型及其尿液代谢物的影响

阿依古·吐热克，米合勒阿依·艾克帕，巴吐尔·买买提明，麦合苏木·艾克木，阿不都热依木·玉苏甫

(新疆医科大学1维吾尔医学院，2中心实验室，乌鲁木齐　830011；3新疆维吾尔自治区中医民族医药管理局，乌鲁木齐　830001)

铁线蕨总黄酮对哮喘大鼠模型及其尿液代谢物的影响

阿依古·吐热克1，米合勒阿依·艾克帕1，巴吐尔·买买提明2，麦合苏木·艾克木1，阿不都热依木·玉苏甫3

(新疆医科大学1维吾尔医学院，2中心实验室，乌鲁木齐830011；3新疆维吾尔自治区中医民族医药管理局，乌鲁木齐830001)

摘要：目的探讨铁线蕨总黄酮(TXJF)对哮喘模型大鼠及其尿液代谢物的影响。方法选取60只健康雄性SD大鼠，采用OVA致敏及雾化吸入方法，建立哮喘大鼠模型，随机分为正常对照组，阳性对照组(醋酸地塞米松)，哮喘模型组，铁线蕨总黄酮(TXJF)组(高、中、低剂量)各组10只，TXJF组以TXJF进行灌胃给药，检测各组大鼠肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞数目及分类，肺组织病理形态学改变，测定血清免疫球蛋白E(IgE)，从而进行模型的评价及观察TXJF对哮喘模型大鼠的影响。收集大鼠尿液，利用核磁共振波普(1H-NMR)技术检测氢谱，从而建立大鼠尿液代谢指纹谱，正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)，运用偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)观察各组大鼠尿液中代谢产物的差异性。结果与正常对照组相比较，哮喘模型组大鼠出现哮喘样症状，BALF中细胞总数及炎症细胞百分率升高，肺组织出现病理学改变，血清IgE水平升高；TXJF组大鼠哮喘样症状有所好转，BALF中细胞总数及炎症细胞百分率下降、肺组织病理改变情况减轻；与哮喘模型组比较，TXJF组血清IgE水平下降。哮喘模型组尿液中异亮氨酸、柠檬酸、琥珀酸、甘氨酸、丙氨酸含量降低，乳酸含量升高。与哮喘模型组相比较，高剂量TXJF组中异亮氨酸、琥珀酸、柠檬酸、肌酸、牛磺酸、丙氨酸、甘氨酸含量升高，乳酸等含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论TXJF能够改善哮喘大鼠的一般情况，减轻肺组织病理改变，降低血清IgE水平，降低肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞数目及分类，并且对哮喘大鼠尿液代谢物具有显著的影响，从而起到治疗哮喘的作用，其作用机制可能与作用于哮喘大鼠体内的氨基酸代谢、能量代谢等多种代谢途径有关联。

关键词：铁线蕨总黄酮(TXJF)；哮喘大鼠模型；尿液代谢物

中图分类号：R963

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-0590-08

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.016

基金项目：新疆维吾尔自治区卫生和计划生育委员会人才培养计划项目(2016-03-12)

作者简介：阿依古·吐热克(1989-)，女，在读硕士，研究方向：药效物质基础及作用机理。

通信作者：阿不都热依木·玉苏甫，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：药效物质基础及作用机理，E-mail：ayusup@126.com。

本文引用：阿依古·吐热克，米合勒阿依·艾克帕，巴图尔·买买提明,等.铁线蕨总黄酮对哮喘大鼠模型及其尿液代谢物的影响[J].新疆医科大学学报,2018,41(5):590-596,601.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.016

EffectsofthetotalflavonoidsofAdiantumcapillus-venerisL.onasthmaratmodelandurinarymetabolites

AyiguTureke1,MiheleayiAikepa1,BatuerMaimaitiming2,MaihesumuAikemu1,AbdiryimYusup3

(1InistituteofTraditionalUyghurMedicine；2CentralLaboratory，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China；3AdministrationBureauofTraditionalChineseMedicineandEthnicGroupMedicineofXinjiangUyghurAutonomousRegion,Urumqi830001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of total flavonoids ofAdiantumcapillus-venerisL.on asthma rat models and their urine metabolites.MethodsFifty healthy male Sprague-Dawley rats were to sensitize and inhale by OVA to establish an asthmatic rat model.The rats were randomly divided into normal control group,positive control group(dexamethasone acetate group),asthma model group,and TXJF(high,medium,and low-dose)groups(each group has 10 rats),and TXJF was administered intragastrically.The number and classification of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF),the histopathological changes of lung tissue and the serum IgE level were detected to model evaluation and observe the effect of TXJF on asthma model rats.The rat urine and the proton spectrum was detected by nuclear magnetic resonance(1H-NMR)technique to establish the metabolic fingerprint of rat urine.The difference in metabolites between urine metabolites of rats in each group were observed using the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)and Partial Least Squares Discriminant Analysis(PLS-DA).ResultsCompared with the normal control group,the asthma model group showed asthma-like symptoms,the total number of cells and inflammatory cells in the BALF increased,the pathological changes appeared in the lung tissue,serum IgE levels increased;asthma-like symptoms in the TXJF group rats were improved,the percentage of total cells and inflammatory cells in the BALF decreased,and the pathological changes in the lung tissue alleviated.Compared with the asthma model group,serum IgE levels in the TXJF group decreased.The levels of isoleucine,citric acid,succinic acid,glycine,and alanine in the urine of the asthma model group decreased,and the lactate content increased.Compared with the asthma model group,the content of isoleucine,succinic acid,citric acid,creatine,taurine,alanine,and glycine in the high-dose TXJF group increased,and the content of lactic acid decreased.The difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionTXJF can improve the general condition of asthmatic rats,reduce the pathological changes of lung tissue,reduce the level of serum IgE,decrease the number and classification of inflammatory cells in BALF,and have significant effect on urinary metabolites in asthmatic rats,thus it plays a role in the treatment of asthma.The mechanism of action may be related to various metabolic pathways such as amino acid metabolism and energy metabolism in asthmatic rats.

Keywords:Total flavonoids of Adiantum(TXJF);asthmatic rat model;urine metabolites

铁线蕨(Adiantumcapillus-venerisL.)为铁线蕨科多年生常绿草本植物，含有挥发油、多糖类、黄酮类、生物碱类及萜类等化学成分[1]，具有止咳化痰、消炎止痛、温肾利尿、抗炎抑菌、调节血糖平衡、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[2]，主要用于伤风感冒、哮喘、头疼胸痛、久咳多痰、等疾病的治疗[3-7]。本课题组前期研究发现铁线蕨总黄酮(TXJF)具有抗炎、平喘、止咳及祛痰作用并呈剂量依赖性[8]，但其抗哮喘作用及作用机理尚不明确。哮喘是由多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病，因其发生与发展的病因诸多、复杂，至今对其机制尚未解释清楚。代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，具有整体、动态、综合与分析的特点，与中医药的整体观、系统观及辨证论治方式不谋而合，被越来越多的应用于中药药效及作用机理等研究[9-11]。本研究在建立哮喘大鼠模型的基础上干预TXJF，测定灌洗液(BALF)细胞总数及炎症细胞百分率，观察大鼠肺组织病理学改变，检测大鼠血清总IgE水平，观察TXJF对大鼠哮喘模型的影响，并利用核磁共振波普(1H-NMR)技术测定TXJF对哮喘模型大鼠尿液代谢物的变化，旨在为TXJF的抗哮喘作用及可能的作用机理方面提供依据，现报道如下。

1　材料

1.1试剂与药品卵清蛋白(美国Sigma公司，批号A5253)，20%氢氧化铝胶生理盐水(齐鲁动物保健品有限公司，批号1507006)，醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号151288)，0.9%氯化钠注射液(国药集团新疆制药有限公司，批号1608008)，4%多聚甲醛固定液(北京索莱宝生物科技有限公司，批号AR10680)，苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(上海莼试生物技术有限公司，批号C0106，C0107)，重水(美国CIL公司，批号R03010104)，大鼠免疫球蛋白E(IgE)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号E-EL-R0517c)。

1.2仪器C2500-R-230V型高速离心机(美国Labnet公司)，ICV-450型电热恒温培养箱(日本ASONE公司)，MK3型酶标仪(美国Thermo Fisher公司)，W004型压缩式雾化器(江苏富林医疗设备有限公司)，Inova-600型核磁共振波谱仪(美国Varian公司)，GS-15R型低温高速离心机(美国Beckman公司)，DW-86L286型超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)，WG-1000-7型核磁管(美国Wilmad-Labglass公司)，BSA224S-CW型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，RM2245型病理切片机、100-04型图像分析仪和DM 3000型显微镜(德国Leica公司)。

1.3药材铁线蕨全草2016年6月购自新疆维吾尔自治区维吾尔医院药房，经该医院艾尼瓦尔·塔力甫主任药师鉴定为铁线蕨科多年生常绿草本植物铁线蕨(Adiantumcapillus-venerisL.)的干燥地上部分。

1.4动物SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(200±30)g，购自于新疆医科大学动物实验研究中心并提供饲料，动物许可证号SCXK(新)2016-0003。

2　方法

2.1铁线蕨总黄酮提取物(TXJF)的制备[12]称取铁线蕨药材5 kg，加25倍量50%乙醇回流提取2次，每次2 h，收集提取液，减压浓缩得铁线蕨提取物。以聚酰胺树脂吸附法纯化，选用60～100目聚酰胺树脂，将聚酰胺树脂用水和无水乙醇各3 BV洗脱除杂后开始上样，上样液质量浓度5.412 6 g/L，流速1.0mL/min，上样完成后家70%乙醇6 BV洗脱，收集第2～6 BV洗脱液，减压浓缩，恒温真空干燥，得铁线蕨总黄酮粉末，备用。以芦丁为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色剂，采用紫外-分光光度法测得铁线蕨总黄酮的质量分数51.01%。

2.2动物分组、造模及给药将SD大鼠60只随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组、哮喘模型组、阳性对照(醋酸地塞米松)组及TXJF高、中、低剂量组，各组大鼠均在清洁动物房内用普通饲料饲养，相对湿度60%～80%，温度(26±3)℃，自由饮食和饮水，适应性饲养1 W后，于第1、8天，除正常对照组以外其余组以10%卵清蛋白混合溶液[卵清蛋白(OVA)10 g+氢氧化铝胶生理盐水100 g] 1mL腹腔注射致敏，正常对照组以生理盐水1mL代替，从第15天开始每天将正常对照组(等量生理盐水)，哮喘模型组(等量生理盐水)，阳性对照组(醋酸地塞米松0.3mg/kg)和TXJF高、中、低剂量组(0.8，0.4，0.2 g/kg)大鼠灌胃给药，30min后分别置于密闭式自制有机玻璃雾化箱内，以10% OVA雾化吸入 20min激发引喘，每天1次，连续16 d。在雾化过程中观察各组大鼠的一般状态，哮喘模型组出现皮肤痒、绕鼻、腹式呼吸、呼吸频率加速加深、焦躁不安、仰头呼吸、张口呼吸、四肢瘫软及行动迟缓等病一系列哮喘样症状。正常对照组未见上述症状，阳性对照组及TXJF高、中、低剂量组中可见上述症状以不同程度的改善。

2.3标本采集各组动物末次激发后放在代谢笼，收集24h内尿液，尿液里加入0.1%叠氮钠溶液(NaN3)100μL，4℃，10 000 r/min离心10min，取上清液，置于-80℃冰箱保存，用于1H-NMR检测；由大鼠腹主动脉采血，收集好的血液样本4℃，3000 r/min离心10min，分离血清，置于-80℃冰箱保存，用于血清IgE水平测定；迅速打开胸腔，露出气管和肺，从甲状软骨上部切开V形裂口，插入磨平的针头，用线结扎固定，注入5%生理盐水(冷藏)3mL，立刻回抽，收集灌洗液(BALF)，灌洗3次，回收的BALF以4℃，3000 r/min离心10min。将沉淀物置于-4℃冰箱内保存，用于BALF中细胞总数计数及分类。取大鼠右肺中叶，以4%多聚甲醛溶液固定，组织石蜡包埋，于内三分之一处进行连续切片(切片厚度约3 μm)，以HE染色试剂盒进行染色，观察肺组织炎症细胞浸润情况。

2.4BALF中炎症细胞总数计数及分类及血清IgE水平检测将BALF离心后沉积物用10%小牛血清PBS100μL悬浮细胞，吸取0.1mL置于细胞计数板上，细胞总数在显微镜下计数。取0.01mL涂片，制作3张涂片及瑞氏染色，进行细胞计数分类，测量细胞总数与Ly、Neu、Eos的百分比。严格按照大鼠血清IgE水平ELISA检测试剂盒说明书，检测各组大鼠血清IgE水平。

2.51H-NMR尿液样品的处理解冻尿液样品至常温，取400μL尿液加入以重水配制的200μL磷酸盐缓冲液，将混合液用低温离心机以4℃，10 000 r/min，离心10min，取上清混合液550μL移入至5mm的核磁管里，用于核磁共振检测。

2.61H-NMR数据采集与预处理尿液1H-NMR谱的测试是用Inova600型核磁共振波谱仪，NOESYPRESAT-ID脉冲序列进行氢谱测定，测试温度为25℃，频率为600 MHz，扫描次数为128次，采样数据点为32 k，谱宽为10 000 Hz，采样时间推延2s，抑制水峰是以预饱和方法来进行。1H-NMR图谱用MestReNova-6.1软件进行手动调整基线及相位，以乳酸化学位移1.32 ppm的质子信号作为标准进行定标，在0.5～9.0 ppm范围内将图谱进行自动积分，在4.68～5.20 ppm段消除水峰的信号。

2.7统计学处理

2.7.2尿液样品1H核磁共振图谱(1H-NMR)数据采用SIMCA-P+11软件对数据进行统计学分析，分析方法为(1)偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)[13]：主要用于检验模型的有效性分析；(2)正交偏最小二乘判别分析[14](OPLS-DA)：主要用于协助验证模型的有效性以及发现2组之间存在的差异有显著性变化的物质。

3　结果

3.1肺组织HE染色观察及分析正常对照组大鼠支气管上皮组织完整，肺泡间隔及腔内无明显炎症细胞浸润。哮喘模型组大鼠细小支气管壁及伴行血管周围有大量的炎症细胞浸润，以淋巴细胞和嗜酸性粒细胞为主，肺泡腔内炎性细胞渗出。气道黏膜皱褶增多，出现黏膜脱落情况，平滑肌明显增厚，管腔变窄，部分肺泡壁断裂，融合成肺气肿，肺大泡。阳性对照组大鼠与TXJF组大鼠中上述病理改变较哮喘模型组减轻，但未痊愈，见图1。

3.2各组大鼠BALF中细胞总数及Ly、Eos、Neu百分率的比较与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠BALF中细胞总数及Ly、Neu 、Eos百分率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，TXJF高、中、低剂量组大鼠 BALF 中细胞总数及Ly、Neu、Eos百分率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，而且呈剂量依赖性，见表1。

3.3各组大鼠血清IgE水平的检测结果与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠血清IgE水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与哮喘模型组比较，阳性对照组及TXJF高、中剂量组大鼠血清IgE水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，TXJF低剂量组大鼠血清IgE水平变化不明显，见表1。

图1　各组大鼠肺组织HE染色图(×200倍)

表1　各组大鼠BALF中的细胞总数及各种炎症细胞的百分率比较

注：对正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与TXJF高剂量组比较，△P<0.05。

3.41H-NMR分析结果

3.4.1尿液中主要代谢物的1H-NMR归属通过1H-NMR谱图对6组大鼠尿液中的差异性代谢产物成分信号进行了判别分析及归属。有差异性的内源性代谢物有异亮氨酸，乳酸，丙氨酸，胆碱，糖蛋白，乙酰乙酸，琥珀酸，柠檬酸，肌酸，甘氨酸，苯丙氨酸，牛磺酸，肉碱，二甲胺，尿马酸，甲酸，不饱和脂肪酸，r-氨基丁酸等含量发生变化。这些代谢物存在于氨基酸代谢、糖代谢，脂类代谢，嘌呤代谢，能量代谢等对机体非常重要的多种生物化学转化的过程，故可将1H-NMR氢谱作为哮喘大鼠尿液代谢指纹谱，用来描述大鼠机体病理状况下内源性代谢产物的变化，见图2。

(注 A.TXJF低剂量组；B.TXJF中剂量组；C.TXJF高剂量组；D.哮喘模型组；E.阳性对照组；F.正常对照组)

图2尿液1H-NMR图谱

3.4.2模式识别分析结果将1H-NMR氢谱分段积分后得出的积分值以PLS-DA与OPLS-DA法分析所获得3D空间图与平面散点图。图中直观地反应出各组大鼠尿液样本在空间上的位置，横纵轴各表示主成分，是没有单位的标尺，不同的颜色代表不同的组别，每一个点代表了一个样本，各组样品分布区域基本分开，哮喘模型组与其他组所占的空间基本上相互独立的，表明在代谢成分之间有差异，见图3。在SIM-CA-P+软件中，通过R2X、R2Y和Q2来表示实验过程中所建立模型的质量评价指标。其中R2是所解释的模型差异，Q2是所预测的模型差异。R2、Q2值越接近于1，代表模型拟合度越好，越小代表模型拟合度越差，一般认为模型的预测结果达到“良”的标准必须要Q2>0.4。PLS-DA分析结果显示R2X=0.661，R2Y=0.8，Q2=0.476。Q2>0.4时可以认为模型有一定的可靠性，说明各组大鼠尿液代谢成分上有差异。从OPLS-DA图来看，正常对照组与哮喘模型组，哮喘模型组与阳性对照组，TXJF高剂量组与哮喘模型组，TXJF中剂量组与哮喘模型组，TXJF低剂量组与哮喘模型组的分布区域是完全分开的，无交叉，无重叠，Q2值依次为0.840，0.904，0.962，0.939，0.889。TXJF各剂量组与模型组OPLS-DA两两比较分析结果中哮喘模型组与TXJF高剂量组的Q2=0.962为最高，说明这2组之间差异性最明显。空间分布图(a)和散点图(b)中横纵坐标是没有单位的标尺，表示2个主成分，每个点代表每一个样本，2组之间无交叉，无重叠，明显分成2类，说明有差异，见图4～8。

(注：■正常组●阳性对照组◆哮喘模型组▼高剂量TXJF组▲中剂量TXJF组★低剂量TXJF组)

图31H-NMR谱PLS-DA分析3D得分图

3.4.3各组大鼠尿液差异性代谢物的确认与正常对照组相比，相关系数为负值的表示在哮喘模型组大鼠尿液中含量降低的化合物，正值的表示在哮喘模型组大鼠尿液中含量升高的化合物。与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠尿液中异亮氨酸、丙氨酸、琥珀酸、柠檬酸、肌酸、甘氨酸、苯丙氨酸、牛磺酸含量降低，乳酸、乙酰乙酸、肉碱、二甲胺、不饱和脂肪酸、尿马酸、甲酸含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与哮喘模型组比较，阳性对照组中异亮氨酸、胆碱、糖蛋白、琥珀酸、柠檬酸、r-氨基丁酸等化合物含量升高，乳酸、乙酰乙酸、肉碱、不饱和脂肪酸、甲酸及马尿酸含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与哮喘模型组比较，TXJF高剂量组大鼠尿液中异亮氨酸、胆碱、琥珀酸、柠檬酸、肌酸、牛磺酸、甘氨酸、苯丙氨酸含量升高，乳酸、乙酰乙酸、肉碱、二甲胺、不饱和脂肪酸、甲酸及马尿酸含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与哮喘模型组比较，TXJF中剂量组是大鼠尿液中异亮氨酸、糖蛋白、丙氨酸、琥珀酸、r-氨基丁酸、牛磺酸、甘氨酸、琥珀酸含量升高，甲酸、乳酸、乙酰乙酸、二甲胺含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与哮喘模型组比较，TXJF低剂量组大鼠尿液中异亮氨酸、丙氨酸胆碱、琥珀酸、苯丙氨酸含量升高，乙酰乙酸含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

注：S单峰，d双重峰，t三重峰，q四重峰，m多峰。

4　讨论

实验结果表明哮喘模型建立成功。通过药物干预，阳性对照组、TXJF各剂量组BALF中细胞总数及炎症细胞百分率降低，肺组织病理学改变减轻，IgE水平降低。说明TXJF可能通过抗炎，止咳，平喘作用来降低肺泡灌洗液中的炎症细胞及血清IgE，改善肺组织病理学改变，减轻气道炎症。从1H-NMR结果来看，哮喘模型大鼠尿液中的氨基酸代谢、脂肪代谢、能量代谢等多种代谢途径出现不同程度的紊乱。TXJF干预后出现明显的回调情况，TXJF可能通过影响并调节大鼠机体内的各种代谢通路出现的紊乱即蛋白质代谢有关的异亮氨酸，脂肪代谢有关的不饱和脂肪酸、能量代谢有关的乳酸，丙氨酸，琥珀酸等代谢物而起到减轻大鼠机体的消耗性状态，改善通气和换气功能，改善缺氧状态，增强机体免疫。此结果初步说明，TXJF一方面通过减轻气道炎症、改善肺组织病理改变等途径，另一方面可能通过调节到哮喘模型大鼠体内的多种代谢途径的紊乱来发挥抗哮喘作用。本研究进一步为TXJF的抗哮喘作用及可能的作用机制方面提供了有意义的依据。

[收稿日期：2017-10-02]

(本文编辑施洋)