内皮祖细胞条件培养基对脂肪干细胞成骨分化的影响

2018-06-11丁振飞饶先亮尹宗生

安徽医科大学学报 2018年5期

曹　乐，方　晓，丁振飞，王　涛，黄　威，饶先亮，尹宗生

脂肪间充质干细胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells，ADSCs)具有较强的增殖能力和多向分化潜能，能够满足组织工程对细胞数量和种类的要求，因而被认为比较可靠的应用于骨组织工程的种子细胞来源[1]。但单一的干细胞移植往往因干细胞生存所需微环境在体内难以完全复制，结果导致移植效率较低。虽然人们早已认识到血管化在骨形成和修复中的重要作用，但是成血管细胞能否促进骨再生及其机制尚未完全明了。该研究通过特定的条件培养基培养种子细胞来部分模拟体内多细胞之间相互作用的环境，从而在细胞水平探讨具有成血管潜能的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)通过间接接触对具有成骨潜能的ADSCs的增殖和成骨能力的生物学影响，为阐明血管化与骨形成之间的生物耦联机制提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物80～100 g SPF级雌性SD 大鼠2只； 200～220 g SPF 级雌性SD大鼠4只，均购自安徽省实验动物中心。

1.3大鼠骨髓源EPCs的分离与培养取1只80～100 g SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后使用75% 酒精浸泡15 min，于超净工作台中分离大鼠下肢。剪去大鼠股骨及胫骨骨骺端，吸取F液(大鼠骨髓淋巴细胞分离液试剂盒)反复冲洗髓腔，冲出骨髓置于60 mm培养皿中吹打均匀，1 550 r/min 离心5 min后弃上清液，使用5 ml组织液(大鼠骨髓淋巴细胞分离液试剂盒)将上述骨髓组织重悬备用。将上述备用的组织液重悬的骨髓细胞缓慢加入5 ml淋巴细胞分离液上层，1 550 r/min离心20 min，可见骨髓细胞分层排列于淋巴细胞分离液中，小心吸取其中白色絮状单核细胞层，使用EBM-2培养基重悬清洗2遍后，接种于预先包被纤维黏连蛋白(FN)(20 μg/ml)的6孔板中，放入恒温细胞培养箱内培养，48 h后全量换液，以后每2 d半量换液1次。原代培养的EPCs融合成片后按1 ∶2传代。

1.4大鼠ADSCs的分离与培养参考文献[2]方法，取1只200～220 g SD大鼠， 10%水合氯醛麻醉后使用75% 酒精浸泡15 min，于超净工作台中分离大鼠腹股沟皮下脂肪，使用含1%双抗的PBS清洗3次。将脂肪组织剪碎后加入双倍体积的 0.1% Ⅰ型胶原酶溶液，混合均匀。将密封的离心管置于 37 ℃恒温水浴锅中缓慢震荡消化60 min后，1 200 r/min离心20 min，去除上层油脂、未消化的脂肪组织及纤维结缔组织等。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)重悬细胞，200 μm滤网过滤后，以1 200 r/min离心10 min，去除上层液面漂浮的油脂，重复上述步骤至去净悬浮油脂。使用含10%胎牛血清(fetal calf serum，FBS)的LG-DMEM 重悬细胞，接种于 T25培养瓶中，置于恒温细胞培养箱中培养，以后每3 d换液1次。原代培养的细胞融合成片后按1 ∶3的比例传代培养。 CCK-8法测量ADSCs生长曲线。

1.5免疫荧光检测ADSCs和EPCs表面标志物调整第3代ADSCs和第2代EPCs浓度为3×105/ml，按每孔0.5 ml接种于预先铺好细胞爬片的24孔板中。待细胞贴壁后移除培养基，4%多聚甲醛固定后PBS浸洗3次，山羊血清封闭30 min。于ADSCs爬片上滴加稀释好的兔抗大鼠CD90一抗，EPCs爬片加入稀释好的兔抗大鼠CD133、VEGFR-2一抗，放入湿盒，4 ℃孵育过夜。第2天，PBST浸洗爬片3次后吸干爬片上多余液体，滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20～37 ℃孵育1 h后，PBST浸洗爬片3次。滴加DAPI后避光孵育5 min后，对上述细胞爬片进行核染，PBST洗去多余的DAPI后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察采集图像。

1.6ADSCs和EPCs的功能鉴定

1.6.1ADSCs成软骨诱导分化第3代ADSCs生长80%～90%融合后，使用成软骨诱导分化培养基培养3周，甲苯胺蓝染色后镜下观察，以细胞被甲苯胺蓝染成蓝色为阳性结果。

1.6.2ADSCs成骨诱导分化第3代ADSCs生长至80%～90%融合时，用成骨诱导分化培养基培养3周，茜素红染色后镜下观察，以细胞基质被茜素红染成红色为阳性结果。

1.6.3ADSCs成脂诱导分化第3代ADSCs生长至100%融合或者过融合后，使用成脂诱导分化培养基A液培养3 d ，诱导3 d 后换为成脂诱导培养基B液，A液和B液交替作用3～5次。油红O染色后镜下观察，以ADSCs 胞质中可见有大小不等红染的脂滴形成为阳性结果。

1.6.4EPCs体外成血管能力参考文献[3-4]方法，取96孔板，按每孔50 μl铺被基底胶于皿底，胰酶消化第2代EPCs，制备浓度为2×104/ml的EPC细胞悬液接种于各孔，轻轻振荡均匀，培养箱中孵育12 h。倒置显微镜观察，以能形成管腔样结构为阳性结果。

1.6.5EPCs吞噬功能参考文献[4]方法，取融合度达80%的第2代EPCs，加入4 μg/ml的Dil-acLDL，培养箱中孵育4 h。PBS洗3次后多聚甲醛固定15 min，加入10 mg/L的FITC-UEA-1，孵育1 h。激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。 Dil-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

1.7制备内皮祖细胞条件培养基(EPC-CM)取经过鉴定的原代培养后1～2代的EPCs, 以每孔1×105个细胞接种至6孔板中，待细胞达到80%～90%融合后，换用不含FBS的LG-DMEM，于1%氧浓度培养48 h后收集旧培养基，3 000 r/min离心10 min，取上清液即为EPC条件培养基。重复制备，直至足量。经0.22 μm滤膜过滤后，贮存于-80 ℃ 冰箱中备用。

1.8CCK-8法检测不同浓度EPC-CM培养的ADSCs增殖活性取第2代ADSCs，用含10% FBS的LG-DMEM培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为 2×104/ml，按每孔100 μl接种于96孔培养板内，培养24 h后，吸除原培养基后，以含1%的FBS生长培养基饥饿处理24 h后，加入含1%FBS的不同浓度EPC-CM 100 μl，分别为对照组(使用LG-DMEM培养)、50%EPC-CM组(使用50% EPC-CM+50%LG-DMEM培养)和100%EPC-CM组(使用100%EPC-CM培养)，每组设3个复孔。继续培养24 h后，每孔加入含10% CCK-8的LG-DMEM 100 μl， 37 ℃反应4 h，酶标仪检测450 nm波长处的吸光度(absorbance， A)值，表示各组ADSCs增殖活性。各组设与实验平行不加细胞只加培养液的空白对照，以空白孔A值调零后比色。以后每天重复上述CCK-8增殖实验，共检测7 d 。上述细胞增殖实验重复3次。

1.9定性分析碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)及钙结节取第2代ADSCs，用含10% FBS的LG-DMEM培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为5×104/ml，按每孔1种于24孔培养板内，培养24 h后，吸去培养基。将24孔板中细胞按EPC-CM浓度分为3组：对照组、50% EPC-CM组和100%EPC-CM组。每组加入0.5 ml成骨诱导培养基和0.5 ml不同浓度的EPC条件培养基。参考文献[5]方法，在培养第14天及第21天分别进行ALP及钙结节的定性检测。使用(BCIP/NBT)ALP显色试剂盒进行ALP染色，倒置显微镜下观察并采集图像。使用茜素红染料对钙结节进行染色，倒置显微镜下观察并采集图像。

1.10定量分析ALP及钙离子含量按上述分组，每组选取24孔板中6孔进行定量分析。在培养第14天、21天进行钙离子定量分析，进行定量分析之前48 h换液，茜素红染色后，每组加入1%氯化十六烷基吡啶400 μl，室温反应10 min后，酶标仪检测560 nm波长处的A值，以A值表示各组中钙离子含量。最后以空白孔A值调零比色。实验重复3次。进行ALP定量检测前，首先PBS冲洗细胞2次，0.1% Triton-X100裂解细胞后收集裂解液，12 000 r/min离心10 min后取上清液按ALP检测试剂盒指示进一步行ALP定量检测。实验重复3次, ALP活性以U/L表示。二喹啉甲酸(BCA)法测定各组细胞总蛋白浓度作为参照。

2　结果

2.1EPCs的培养和鉴定EPCs约72 h后可见细胞贴壁，5 d后可见长梭形细胞集落形成，8～10 d可见细胞达到80%～90%融合，细胞集落呈典型“铺路石”状(图1A)。第二代EPCs免疫荧光鉴定结果显示：VEGER-2阳性(图1B、1C)， CD133阳性(图1D)。在铺被基质胶的96孔板中可形成“管腔样”结构 (图2A)，且能够摄取乙酰化低密度脂蛋白(图2C)和荆豆凝集素-1(图2D)，表明目的细胞为EPCs。

2.2ADSCs的培养和鉴定ADSCs于48 h贴壁，原代细胞形态不均一，呈成纤维细胞样的长梭形(图3A)。培养48 h后可见集落形成；培养约7 d时细胞铺满，经传代培养后形态逐渐均一呈“旋涡”(图3B)。CCK-8检测ADSCs增殖曲线与文献[6]报道的ADSCs生长趋势一致。第二代ADSCs免疫荧光鉴定显示：CD90阳性(图3C、3D)。经诱导分化培养后能向成骨、成脂及成软骨方向分化(图4)。表明目的细胞为ADSCs。

图1　EPCs形态学鉴定　×100

A:EPCs原代培养7 d；B：DAPI细胞核染阳性；C：FITC标记的VEGFR-2染色阳性；D：TRITC标记的CD133染色阳性

图2　EPCs的功能鉴定

A：EPCs具有成血管能力×100；B：DAPI细胞核染阳性×200；C：摄取乙酰化低密度脂蛋白能力(阳性)×200；D：结合FITC-UEA-1能力(阳性)×200

2.3ADSCs的增殖活性CCK-8法检测ADSCs增殖能力：生长培养基培养ADSCs可见ADSCs增殖曲线与文献报道一致(图5A)。随着EPCs条件培养基浓度的增加，ADSCs的增殖活性逐渐增加。ADSCs培养7 d 时间内可见3组ADSCs增殖趋势相一致(图5B)。50%EPC-CM组和100%EPC-CM组的ADSCs在各个时间点的增殖活性均高于对照组，差异有统计学意义(表1)。且除外第3天，100%EPC-CM组的ADSC在各时间点的增殖活性高于50%EPC-CM组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5C、表1。

图3　ADSCs形态学鉴定　×100A:ADSCs原代培养5 d；B：第二代ADSCs；C：DAPI细胞核染阳性；D：FITC标记的CD90染色阳性

图4　ADSCs的功能鉴定　×100

A：ADSCs成脂诱导分化后油红O染色阳性；B：ADSCs成软骨诱导分化后甲苯胺蓝染色阳性；C：ADSCs成骨诱导分化后茜素红染色阳性

表1　3组中ADSCs 1～7 d的吸光度值与统计学检验F值

2.4ALP和钙离子的定性检测ADSCs培养14 d及21 d后，ALP染色可见细胞内蓝黑色颗粒物，且随着时间和EPC-CM浓度的增加，各组中染色均可见蓝紫色颗粒物，见图6。随着诱导培养时间的延长，各组中茜素红染色均可见红染的钙结节，见图7。

2.5ALP和钙离子的定量检测ALP活性检测：ADSCs诱导培养14 d 后， 50%EPC-CM组中ALP活性与对照组相比，差异无统计学意义，而100%EPC-CM组中ALP活性显著高于对照组和50%EPC-CM组，差异有统计学意义(F=42.085、56.400，P<0.01)。诱导培养21 d 后，50%EPC-CM组与100%EPC-CM组ALP活性均高于对照组，差异有统计学意义(F=11.211、18.304，P<0.01)，且100% EPC-CM组ALP活性高于50%EPC-CM组，差异有统计学意义(F=5.981，P<0.05)，见图8。钙离子定量检测(A560检测)：诱导培养14 d 时，50%EPC-CM组和100%EPC-CM组的钙离子含量均高于对照组，差异有统计学意义(F=420.346、3 685.101，P<0.01)；诱导培养21 d 时，50% EPC-CM组和100% EPC-CM组的钙离子含量均高于对照组，差异有统计学意义(F=91.933、174.840，P<0.01)。见图9。

图5　ADSCs增殖曲线

A：ADSCs于生长培养基中增殖曲线；B：三组ADSCs生长曲线；C：三组ADSCs增殖速率柱状图；与对照组比较：*P<0.05；与50%EPC-CM组比较：#P<0.05

3　讨论

髓芯减压和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植对于早期股骨头坏死的治疗是可选的方案。但部分患者术后未能达到理想效果[7]。影响手术成败的因素包括股骨头坏死灶的大小，坏死的病因，以及移植所用的MSCs的活性[7-8]。有研究[9]表明激素性股骨头坏死和酒精性股骨头坏死的患者，其骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells ,BMSCs)的成骨活性大大降低，这可能是导致手术失败的原因之一。为了应对手术失败的风险，寻找其他来源的MSCs就显得非常重要。Wyles et al[1]已经证实，人来源的ADSCs在体外的增殖活性和成骨能力均高于BMSCs。Strioga et al[6]报道这可能是因为ADSCs来源于脂肪，在人体中更类似于生理缓冲区，BMSCs则需要不断适应身体动态环境的刺激。且相比较与BMSCs，ADSCs具有多向分化能力，而且只需要极小的创口下即可在人体的脂肪组织中获取，其体外扩增速度远高于BMSCs，是组织工程可以选用的优良种子细胞。

尽管MSCs和EPCs之间的直接和间接相互作用机制仍未能完全阐述清楚，但是Kim et al[10]已经证实了骨髓来源的细胞能够表达和分泌血管内皮生长因子(VEGF)等数种细胞因子，而VEGF能够促进间充质干细胞的增殖和成骨分化能力[11]。ALP是一种细胞成骨的早期标志物，Zhao et al[12]已经证实在EPCs和MSCs直接共培养的情况下ALP活性会出现明显增加，但难以确定这种作用是否只存在于两种细胞直接接触的情况下，以及细胞分泌的VEGF等细胞因子对这种促进作用是否具有影响。体外环境与体内环境不同，体外环境在可控范围内可以避免大部分的其他细胞和分泌蛋白的干扰，体外环境也更容易控制，能够真实地反映实验因素产生的影响，所以本实验采用在体外分离培养两种细胞，通过制作EPCs的条件培养基培养MSCs，以研究EPCs分泌的细胞因子对于MSCs的增殖与分化是否仍存在影响。

在骨的发育、修复、重构等过程中，快速的血管化可以供应给骨质内部细胞足够的营养、氧气并帮助其运送代谢废物。同时在组织工程中血管还可以帮助运送降解的支架，促进新骨的形成。Kaigler et al[13]将内皮细胞分别培养于3种不同的培养基中，包括单一的生长培养基、加入了VEGF的生长培养基和加入了BMSCs条件培养基的生长培养基。其中后两种培养基中培养的内皮细胞其血管生发速度大大提升。这个实验证实了将成血管细胞与组织工程的种子细胞一起移植，能够大大的促进移植材料的血管化速度。

本实验虽证实了EPCs条件培养基可促进ADSCs的增殖和分化，且随着条件培养基浓度的增加，这种影响也逐渐增强，但并未完全阐明条件培养基中何种细胞因子通过何种方式发挥作用，且未能尽述其中的细胞因子是否具有协同作用或拮抗作用。且体内环境与体外环境存在较大差异，两种细胞在活体内的相互作用方式及相互影响的作用机制仍有待进一步研究。