miR-3129通过抑制hace1促进口腔肿瘤发生的研究

胡利兵，王银龙，朱友明

口腔癌的高发病率和死亡率已经成为严重影响公共健康的疾病之一，口腔癌的复发率存在逐年上升的趋势。口腔肿瘤由于其发生部位、组织来源和肿瘤性质复杂等特点，因此其治疗手段也不尽相同。手术及放、化疗等传统治疗方法可能影响面部容貌、语言功能和人类自身的免疫力等，因此迫切需要寻求更加有效的治疗口腔肿瘤的方法，因此免疫治疗、基因疗法等新兴治疗方法的应用逐渐成为口腔肿瘤治疗研究领域的热点。hace1是一种肿瘤抑制基因，具有抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤细胞凋亡的作用。检测hace1基因在口腔肿瘤中的表达，研究其对口腔肿瘤细胞增殖、迁移能力的影响，预测hace1的miRNA，并研究其hace1的关系，检测miRNA-3129在口腔肿瘤中的表达，探讨miR-3129和hace1是否可以作为口腔肿瘤检测和治疗的一个新靶点。

1　材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1细胞肿瘤细胞株scc-3来源于江苏省药物研究所；病毒包装所用293T细胞由中国科学技术大学细胞生物学吴缅实验室提供。

1.1.2菌种和载体E.colidh5α菌株由安徽医科大学省级口腔重点实验室保存；实验中用于敲低hace1基因的shhace1来源于中国科学技术大学细胞生物学吴缅实验室(购自美国Sigma公司的人和鼠的shRNA库)。实验用于慢病毒包装系统的4质粒(Plko.1、VSV-G、REV、GAG )包装系统由中国科学技术大学细胞生物学吴缅实验室提供，这4个质粒中Plko.1为慢病毒表达载体，另外3个(VSV-G、REV、GAG)为慢病毒包装载体。

1.1.3标本组织来源15例实验标本取自2014年5月～2015年5月经安徽医科大学第一附属医院和安徽省口腔医院颌面外科手术切除、病理证实的涎腺病变组织，对照标本为瘤旁正常组织均来自相应患者肿瘤安全边缘10 mm以上的组织。所有患者除口腔肿瘤病变外，并无其他明显的全身系统性疾病，且所有患者未经放疗、化疗等其它手段治疗。

1.1.4主要试剂DMEM培养基(高糖型)、链霉素和青霉素(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国HyClone公司)；质粒提取试剂盒(美国Axygen公司)；逆转录反应试剂盒、实时定量反应试剂盒(日本宝生物公司)；RNA抽提试剂TRIzol (上海碧云天生物技术有限公司)；噻唑蓝(MTT)、聚凝胺(polybrene)、嘌呤霉素(puromycin)(美国Sigma公司)；酵母提取物、琼脂A、蛋白胨、氯化钠、tris、甘氨酸等(上海生物工程有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，加入链霉素和青霉素，置5% CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱内培养293T细胞和scc-3细胞株，据细胞生长情况，2～3 d传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2过表达hace1的构建及目的基因扩增Pubmed检索人源性的hace1的CDS序列，DNAclub找出hace1CDS序列中存在的限制性酶切位点，设计出hace1基因的引物序列(F：5′-GCGAATTCATGGAGAGAGCGATGGAGCAACTC -3′，上游引物的酶切位点为EcoR Ⅰ，R：5′-GCACGCGTTTATGCCATTGTGTAACCATAGCT -3′，下游引物的酶切位点为Mlu1)，引物均由上海生物工程有限公司合成。以含有待扩增序列的DNA为模板进行PCR反应，30 μl总体积包括：上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，无菌蒸馏水12 μl，2×PfuPCRMasterMix 15 μl。在PCR扩增仪上完成PCR扩增。反应条件如下：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，共30个循环，再72 ℃延伸10 min，置4 ℃保温。琼脂糖凝胶电泳PCR反应产物，紫外监测仪观察电泳结果，并回收目的条带。

1.2.3质粒的扩增和提取将设计的限制性内切酶37 ℃水浴酶切表达载体和对应DNA片段，琼脂糖凝胶电泳酶切产物并回收，并同载体在T4连接酶下连接1 h，再转入感受态大肠杆菌dh5α，24 h后手抽酶切验证，使含有hace1片段载体的大肠杆菌dh5α菌株通过测序获得。

1.2.4shhace1病毒的包装及感染在6孔板中的hek 293T细胞中转染2 μg Plko.1空载或Plko.1-hace1、2 μg pGAG 、2 μg pREV和1 μg pVSVG，先在纯DMEM培养基培养6 h，再更换含有20%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h，含有病毒的培养基上清收集后，用0.45 μm PVDF滤头 (Millipore)过滤上清液。scc-3细胞分别感染过滤后含有病毒的培养基上清液，同时加入 4 μg/ml polybrene (美国Sigma公司)，37 ℃孵育24 h，再更换含10%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h,同时加入5 μg/ml puromycin 筛选细胞。

1.2.5划痕实验检测细胞迁移能力取处于慢病毒感染的对数生长期的scc-3细胞，5×105个/每孔，6孔板中均匀接种，分正常对照组、hace1过表达组和shhace1转染组，均匀划出2条划痕待24 h长至90%后，此时作为0 h时间点，hochest染色细胞，在荧光显微镜下0、24、48 h时分别观察细胞迁移情况，并进行拍照、比较。

1.2.6MTT检测细胞增殖能力按对数生长期的scc-3细胞，分为正常对照组、hace1过表达组和shhace1转染组，96孔板按2 000个/每孔均匀接种，加入体积200 μl/每孔培养基培养，每组设3个复孔，待细胞贴壁后，按时间梯度加入药物，加入20 μl MTT溶液(终浓度为5 g/L),37 ℃孵育4 h，吸走上清液，加入DMSO 150 μl/每孔，震荡10 min，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸收值，并绘制细胞生长曲线。

1.2.7实时荧光定量PCR实时荧光定量逆转录聚合酶连反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, QRT-PCR)检测hace1 mRNA的表达水平，cDNA合成和总RNA提取：取100 mg涎腺肿瘤组织剪碎，TRIzol(日本TaKaRa公司)法获取组织总RNA。再进行逆转录(试剂盒购自日本TaKaRa公司)获得cDNA，置-20 ℃保存备用。QRT-PCR检测hace1 mRNA 的相对表达水平，设计合成经GenBank检索的内参β-actin的引物和hace1。扩增条件：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，在紫外灯下观察电泳后的电泳条带并拍照。

2　结果

2.1hace1在口腔肿瘤组织中的表达hace1作为一个肿瘤抑制基因在很多癌症组织发现了低表达，但是其与口腔肿瘤发生发展的关系一直没有相关报道，通过QRT-PCR方法对比分析收集的15组口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织的hace1 mRNA表达水平，其中12组中口腔肿瘤组织的hace1的mRNA表达水平较瘤旁正常组织低，另外3组中hace1没有发现大的变化(图1)。比较得出，hace1的表达水平在口腔肿瘤组织中相较正常组织呈减少趋势，推断hace1可能与口腔肿瘤的发生相关。

2.2hace1对口腔肿瘤细胞迁移和增殖的影响分别计数对照组和hace1过表达组的scc3细胞，转同样的细胞入12孔板，待细胞完全贴壁后，通过划痕实验检测两组scc-3细胞的迁移速度，结果表明当在scc3细胞中敲低hace1的表达，shhace1组细胞的迁移速度较对照组明显加快(图2)，实验表明，hace1基因能抑制口腔肿瘤细胞的迁移，同样通过MTT试验，比较敲低对照组与hace1敲低组细胞的增殖情况显示，当在scc3细胞中敲低hace1的表达，shhace1组细胞的增殖速度较对照组明显加快(图3)，矩形图表示成功敲低了hace1的表达(图4)，表明hace1基因能抑制口腔肿瘤细胞的增殖，以上说明抑癌基因hace1在口腔肿瘤的发展过程中起着重要的作用。

图1　QRT-PCR法分析口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织的hace1 mRNA表达水平

图2　划痕试验比较敲低对照组与hace1敲低组细胞的迁移情况

2.3miR-3129调节hace1miRNA表达水平的分析hace1在口腔肿瘤中表达水平较低，是何种原因导致hace1的表达水平降低，通过生物信息学的方法，在targetscan 上对hace1的潜在miRNA进行预测显示，miR-3129潜在靶向hace1 3′-UTR 23位

图3　MTT试验比较敲低对照组与hace1敲低组细胞的增殖情况

图4　QRT-PCR检测敲低对照组与hace1敲低组hace1 mRNA的表达水平

～30位的之间的碱基(图5)。通过luciferase试验证实miR-3129的确靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之间的碱基(图6)，当在scc3细胞系中转入miR-3129 mimics，显示hace1的mRNA表达水平发生下调(图7)，而在scc3细胞系中转入miR-3129 inhibiter，显示hace1的mRNA表达水平发生上升(图8)，说明miR-3129通过靶向hace1 3′-UTR调控hace1的表达水平。

图5　miR-3129潜在靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之间的碱基

图6　luciferase试验证实miR-3129靶向>hace1 3′-UTR23位-30位的之间的碱基

1：Psi-victor；2：Psi-hace1 3′-UTR；3：Psi-hace1 3′-UTR-mut

图7　QRT-PCR检测转入miR对照或miR-3129 mimics时hace1 mRNA的表达水平

A：miR-3129的表达水平；B：hace1 mRNA的表达水平；1：miR对照；2：miR-3129 mimics

图8　QRT-PCR检测转入miR对照和miR-3129 inhibiter时hace1 mRNA的表达水平

A：miR-3129的表达水平；B：hace1 mRNA的表达水平；1：miR对照；2：miR-3129 inhibiter

2.4miR-3129在口腔肿瘤组织中的表达miR-3129作为一个miRNA与肿瘤之间的关系至今鲜有报道，其在口腔肿瘤发生发展中发挥什么样的作用，通过对收集的15组口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织的miR-3129进行QRT-PCR对比分析，其中12组中口腔肿瘤组织的miR-3129的mRNA表达水平较瘤旁正常组织高，另外3组中miR-3129没有发现大的变化(图9)。比较得出，miR-3129的表达水平在口腔肿瘤组织中相较于正常组织呈增加趋势，且在口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织中miR-3129与hace1表达呈负相关性，推断miR-3129可能与口腔肿瘤的发生相关。miR-3129可能通过抑制hace1促进口腔肿瘤的发生与发展。

3　讨论

基因治疗通过对肿瘤细胞中途变得原癌基因和抑癌基因的靶向，能有效地治疗肿瘤，肿瘤基因治疗着非常重要的临床意义，其次通过了解各组织器官中那些基因的突变更易导致该部位肿瘤的发生，因此在肿瘤的诊断方面也能提供较好的依据。目前对于口腔肿瘤的原癌基因和抑癌基因主要集中于研究C-myc、ras、c-erbB(原癌基因)和p53、APC、p16、Rb(抑癌基因)等基因[1]。hace1作为一个肿瘤抑制基因与口腔肿瘤发生发展的关系一直没有相关报道，但是已在大多数肿瘤中发现了hace1的突变和失活，提示hace1可能在口腔肿瘤的发展中也起着重要的作用。

hace1是E3泛素接酶HECT家族成员之一,其为位于6q21染色体上的潜在肿瘤抑制基因[2],其功能缺失在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。有研究[3]表明hace1泛素化修饰自噬受体OPTN，泛素化修饰后的OPTN能被自噬蛋白p62所识别，并形成大的自噬受体复合物，增加细胞内通过自噬途径降解氧化损伤的蛋白量，抑制细胞增殖，该通路通过激活细胞自噬并抑制肿瘤。另有报道[4]显示，hace1能泛素化降解Rac1抑制肿瘤的生长，在hace1表达缺失或突变的细胞中，Rac1的活性会被激活或是进一步加强，抑制了肿瘤细胞的凋亡，同时会促进肿瘤的进一步生长或发生侵润和转移。多项研究[5]表明hace1在多数恶性肿瘤中表达下调和突变，如在临床乳腺癌中hace1表达缺失是最常见的突变形式，其蛋白失活在乳腺癌的发展过程中起着关键的作用。Sakata et al[6]分析26例肾母细胞瘤患者中发现，约77%的肿瘤样本中几乎检测不到hace1的mRNA和蛋白质表达。hace1的表达水平在肝癌中表达降低，在直肠癌、肝癌和胃癌中都发现了hace1基因的甲基化，研究[7]显示hace1基因的甲基化与肿瘤的大小，是否淋巴转移存在直接相关性。

图9　QRT-PCR分析口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织的miR-3129 RNA表达水平

miRNA是一类内生的，由内源基因编码的长度在18～24个短序列核苷酸的小RNA分子，miRNA使一类短链非编码RNA，其不能翻译成蛋白质，但是其在生命体中发挥着重要的调节作用，其主要通过基因转录后调控，影响蛋白质的正常表达发挥功能，参与到细胞分化、生长、增殖、衰老和调亡等多种生命活动[8]。研究[9]显示 miRNA-221、miRNA-222的低表达可上调TIMP3表达，从而使乳腺癌细胞系MCF-7的增殖和迁移能力得到抑制。miRNA-27a/b可促进肿瘤血管的生成，并诱导肿瘤转移的发生。研究[10]通过检测485例肠癌患者中miRNA-135b的表达水平显示，miRNA-135b在肿瘤中的表达水平较正常组织约4倍，并且miRNA-135b表达水平最高的患者存活时间最短。另有研究[11]显示miR-34a决定了肿瘤干细胞是进行自我更新还是向分化方向发展，miR-34a通过减少Notch信号，促进细胞分化。近年来国内对于miRNA的研究也取得了重要的进步，研究[12]表明miR-621抑制fbxo11的表达，使得乳腺癌对于化疗更加敏感，研究指出miR-621可作为乳腺癌潜在的治疗靶标。

本次实验对收集的15组口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织的hace1 mRNA表达水平进行QRT-PCR检测，其中12组中hace1的mRNA表达水平口腔肿瘤组织较瘤旁正常组织低，另外3组中hace1未发现多大的变化。可得出，口腔肿瘤组织中hace1的表达水平相较于正常组织呈减少趋势，推断hace1可能与口腔肿瘤的发生相关。另外通过QRT-PCR方法对比分析收集的15组口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织的miR-3129，其中12组中miR-3129的mRNA表达水平口腔肿瘤组织较瘤旁正常组织高，其余3组中miR-3129未发现多大的变化。可得出，口腔肿瘤组织中miR-3129的表达水平相较于正常组织呈增加趋势，且miR-3129与hace1表达在口腔肿瘤组织及瘤旁正常组织中呈负相关性，推断miR-3129可能与口腔肿瘤的发生相关。miR-3129可能通过抑制hace1促进口腔肿瘤的发生与发展。

通过生物信息学的方法预测hace1的潜在miRNA显示，miR-3129潜在靶向hace1 3′-UTR 23位～30位的之间的碱基。且通过luciferase试验得以证实，当把miR-3129 mimics转入到scc3细胞系中，显示 hace1的mRNA表达水平发生下调，而把miR-3129 inhibiter转入到scc3细胞系中，显示hace1的mRNA表达水平发生上升，说明miR-3129是通过靶向hace1 3′-UTR来调控hace1的表达水平。本课题研究显示hace1在口腔肿瘤中低表达，并抑制口腔肿瘤的迁移去增殖，miRNA-3129可靶向hace1 3′UTR，并调节hace1表达水平，miRNA-3129在口腔肿瘤中高表达，与hace1表达成负相关性，可能通过靶向hace1促进口腔肿瘤生长，提示miR-3129和hace1可能作为口腔肿瘤检测和治疗的一个新靶点。