不同剂量单次照射下大鼠急性放射性心脏损伤模型的构建与评价

刘　阳，高世乐，胡宗涛，马金柯，高　杉

放疗是恶性肿瘤的综合治疗不可或缺的组成部分，食管癌、肺癌、乳腺癌、纵膈淋巴瘤等肿瘤组织在接受放射治疗时，与肿瘤组织毗邻的心脏也将受到不同剂量体积的照射，引起无或有临床症状的放射性心脏损伤(radiation-induced heart disease RIHD)[1]。射线可破坏血管内皮细胞、微循环系统损伤、继而使心肌出现缺血性改变、炎性细胞浸润、局灶性或片状心肌纤维化，最终导致心脏结构和功能损伤[2]。虽然因为放射治疗技术的提高等因素，使心脏受照的剂量大大减少，但是射线造成的心脏损伤仍然不容忽视[3]。RIHD的各种并发症对肿瘤患者的生活质量和生存期产生很大影响。目前临床上对预防和治疗RIHD尚无明确的共识。因此如何模拟临床构建RIHD物实验模型，揭示放射性心脏损伤发生的可能机制，对防治RIHD有非常重要的作用。为构建急性RIHD的实验动物模型，该实验通过不同剂量单次照射大鼠心脏，通过不同指标来评价所构建模型的科学性、可操作性，并探讨大鼠氧化应激在RIHD中的作用，从而为下一步试验提供科学、可行的动物模型。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级SD(Sprague Dawley)雄性大鼠40只，8～12周，200～250 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司。

1.2主要实验试剂大鼠心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)试剂盒(批号：2016-11-01)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒(批号：2016-11-01)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒(批号：2016-11-01)购自南京建成生物工程研究所；Masson三色染色液(批号：616011)购自珠海贝索(BASO)生物技术有限公司。

1.3主要仪器与设备ELEKTA SYNERGY直线加速器(瑞典ELEKTA公司)；DL- BD动脉留置针(比迪医疗器械上海有限公司)；510型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；15M低速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；PT-100S生物血压传感器(成都泰盟软件有限公司)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(嘉兴中新医疗仪器有限公司)。

1.4实验方法

1.4.1实验大鼠分组40只SD雄性大鼠随机分为5组：正常、 5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy组。

1.4.2照射方法各照射组大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉后，四肢固定，直线加速器下照射大鼠心脏，剂量率为200 cGy/min, 源皮距为100 cm，照射野2.0 cm×2.0 cm，照射后室温下大鼠自然苏醒，正常组大鼠只腹腔麻醉不做照射处理。

1.4.3一般状况观察动态观察大鼠的毛发、体重、精神状态。

1.4.4大鼠血流动力学指标测定于照射后1、4周末，各组随机取4只大鼠。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，腹腔注射麻醉，固定后，将动脉留置针沿右侧颈总动脉，插入左心室中，后通过生物血压传感器连接至生物机能实验系统。记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、室内压最大上升速率(dp/dtmax)、室内压最大下降速率(-dp/dtmax)等指标。采集大鼠血样本置于EP管中，3 500 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液，-80 ℃条件下备用；处死大鼠后分离心脏组织，将心尖部组织置于10%中性福尔马林溶液中固定备用。

1.4.5大鼠血清中cTnI含量的测定严格按照试剂盒说明书准备，加入样品和标准品，37 ℃水浴锅温育60 min；重复洗板5次；将底物A、 B各50 μl加入每孔中， 37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μl，15 min内，在450 nm 波长处测定各孔的光密度(optical density，OD)值。

1.4.6大鼠血清中SOD和MDA活性测定严格按照试剂盒说明书准备，按其说明书步骤进行。

1.4.7大鼠心脏组织HE染色心尖部组织常规脱水、透明、包埋、切片，厚5 μm，HE染色，中性树胶封片。

1.4.8大鼠心脏组织Masson染色取心脏组织，经常规石蜡包埋，切片后脱蜡至水。Weigert铁苏木素(A液和B液等比例混合)染5～10 min，流水稍洗。1%盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟。丽春红酸性品红染液染5～10 min，流水稍冲洗。磷钼酸溶液处理约5 min，不用水洗，直接用苯胺蓝染液复染5 min。1%冰醋酸处理1 min，95%酒精脱水多次。无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2　结果

2.1一般状况实验期间，正常组大鼠进食饮水正常、毛发无脱落、精神尚可。各照射组大鼠有精神不佳、饮食减少、体重增加减慢等表现，其中20 Gy、30 Gy组较5 Gy、10 Gy组严重，并且30 Gy组大鼠在实验期间死亡1只，30 Gy组部分大鼠实验期间可观察到照射野区域毛发减少，皮肤破溃后结痂等。见图1。

图1　30 Gy剂量照射组大鼠皮肤外观变化情况

2.2心脏血流动力学参数照射后1周，与正常组比较，各照射剂量组心脏血流动力学指标无明显变化(P>0.05)；照射后4周，与正常组比较，5 Gy、10 Gy组心脏血流动力学指标无明显变化，20 Gy和30 Gy组心脏血流动力学指标变化明显(P<0.05)，两组间变化不明显。见图2、3。

2.3血清cTnI含量照射后1周，与正常组比较，各照射组大鼠血清中cTnI含量明显升高(P<0.05)；组间比较，20 Gy和30 Gy组cTnI含量都较5 Gy和10 Gy组明显升高(P<0.05)。受照4周后，与对照组比较，血清中cTnI含量明显升高(P<0.05)；各组间比较显示cTnI含量随剂量升高而升高(P<0.05)。见表1。

2.4血清SOD、MDA活性照射后1周，与正常组相比，各剂量组MDA指含量显升高(P<0.05)；SOD活性明显降低(P<0.05)。照射后4周，与正常组比较，各剂量组SOD指标明显降低、MDA指标明显升高(P<0.05)；组间比较显示：20 Gy和30 Gy组SOD活性较5 Gy和10 Gy组明显升高(P<0.05)；MDA含量随剂量升高而升高(P<0.05)。见表2。

2.5心脏HE、Masson染色

2.5.1HE染色光学显微镜100倍视野下正常组大鼠心肌细胞呈长条有序排列，胞质淡红色，核深蓝色，心肌结构无明显损伤。受照1周后，与正常组比较，各照射组大鼠心肌改变不明显；受照4周后，与正常组比较，各照射组均有不同程度的细胞水肿、炎性细胞浸润、以及部分心肌细胞断裂。见图4、5。

2.5.2Masson染色可观察到心肌纤维呈红色，胶原纤维呈淡蓝色，细胞核呈蓝黑色。照射后4周后，光学显微镜200倍视野，可见较正常组增多的胶原纤维主要分布于心肌细胞间质和血管周围。见图6。

表1　1和4周末大鼠血清中cTnI含量

与正常组比较：#P<0.05；与20 Gy组比较：*P<0.05

图2　1周末大鼠心脏血流动力学参数变化

项目正常组5 Gy组10 Gy组20 Gy组30 Gy组F值SOD(U/ml) 1周190.52±9.65151.29±14.94#145.69±18.80#123.28±9.65#108.33±40.69#7.28 4周196.97±14.72161.45±22.69#*155.75±9.80#*127.26±12.98#106.36±34.53#10.94MDA(nmol/ml) 1周4.15±0.284.94±0.22#*5.63±0.14#*7.22±0.40#8.42±0.14#*184.00 4周4.03±0.244.56±0.28#*5.24±0.16#*6.85±0.21#7.54±0.28#*152.70

与正常组比较：#P<0.05；与20 Gy组比较：*P<0.05

图3　4周末大鼠心脏血流动力学参数变化

A:4周末LVSP；B:4周末LVEDP；C:4周末dp/dtmax；D:4周末-dp/dtmax；与正常组比较：#P<0.05；与20 Gy组比较：*P<0.05

图4　1周末大鼠心脏病理组织学变化　HE×100

图5　4周末大鼠心脏病理组织学变化　HE×100

图6　4周末大鼠心脏病理组织学变化　Masson×200

3　讨论

有文献[4]报道，心脏在遭受20 Gy剂量单次照射后即可产生不可逆性损伤，因此本实验通过观察不同剂量照射构建模型造成不同损伤的特点，从而为下一步试验提供科学、可行的动物模型。

在构建大鼠RIHD模型的实际操作过程中如何较为简易地确定大鼠心脏在体表的位置，尽可能缩小照射野的范围，对后续实验举足轻重。本研究随机抽取小部分大鼠(5只)，利用心脏超声，来估测大鼠心脏在体表定位，大致为以大鼠两上肢水平连线和胸正中线交点下2～3 cm处为中心点，做2 cm×2 cm正方形。

在照射后早期，心脏自身具有一定程度抵抗外界刺激的代偿机制，心脏收缩和舒张功能改变不明显。然而照射后心脏损伤始终存在，随着观察时间增加，收缩和舒张功能明显降低，并且和剂量呈正相关性。文献[4]报道，构建急性RIHD模型时，小于10 Gy剂量的照射不会导致心脏功能的变化，大于20 Gy的照射剂量更为适合。随着实验时间节点的进一步延长，低剂量组是否会出现心脏损伤，有待于进一步实验证实。

作为晚反应组织的心脏，心肌细胞更新较慢，可以在一定程度上耐受射线直接或间接的照射[5]。有文献[6-7]证实，急性RIHD，一般多见于照射后1个月内，以心肌细胞水肿、炎性细胞浸润、纤维蛋白渗出为主，而心肌细胞纤维化发生缓慢。本实验病理HE染色可观察到照射早期急性期心肌细胞病理改变并不明显，照射4周后有不同程度的心肌细胞损伤；Masson染色结果同样也证实心肌纤维化的发生具有时间相关性。

心肌酶中以cTnI对诊断早期放射性心脏损伤的敏感性和特异性较高，心肌损伤后出现时间早，持续时间长，优于cTnT、CK、CK-MB[8-10]。本实验结果显示，cTnI含量的改变与照射剂量具有正相关性。

机体内氧自由基与抗氧化物质始终处于相对的动态平衡，是机体内机体内稳态的重要组成部分[11]。SOD和MDA是检测机体内氧化和抗氧化水平的重要指标[12]。电离辐射所致的氧化应激对心肌细胞影响较大[13]，当大鼠心肌细胞受到电离辐射刺激时，氧化及抗氧化失衡，导致SOD含量降低，MDA含量升高，并且与照射剂量具有正相关性。

综上所述，心脏损伤的严重程度与剂量相关，不同剂量单次照射构建大鼠急性RIHD模型有不同特征。5 Gy和10 Gy照射组，在氧化应激和心肌酶指标上差异明显，而心功能变化不明显，20 Gy和30 Gy照射组在各检测指标上都有明显差异，30 Gy照射组有一定死亡率，并且在某些指标和20 Gy相比改变不明显，综合考虑20 Gy照射可较好的评估急性RIHD情况。氧化应激在RIHD的发生、发展中扮演重要角色，但后续的信号传导通路有待实验进一步证实。