木薯酒发酵过程中的有机酸变化及对其品质的影响分析

张 婷，陈小伟，张 琪，张沙沙，薛淑龙，蒋立新，范昊安，程勇杰，姚 刚，于林凯，毛建卫，蔡海莺*

（1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，浙江 杭州 310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023；3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江 杭州 310023）

木薯（Manihot esculentaCrantz）又名南洋薯、树薯，与甘薯、马铃薯并称之为世界三大薯类。其原产地为美洲热带，19世纪20年代中国成功引入，目前广泛分布于广西、广东和海南等地区。木薯富含矿物质、维生素、微量元素和大量碳水化合物，其中淀粉含量为10%～30%，蛋白质含量约为1%～2%，纤维素含量约为1%～2%，脂肪含量约为0.3%～4.3%[1-2]，因此其获得“地下粮仓”之美誉。但木薯含有少量有毒物质——氰化物，需要有效的脱毒技术来降低甚至去除其毒性。SAKA J D K等[3]采用水浸法测定剥皮和未剥皮木薯块根的总生氰糖苷减少量，结果发现剥皮后的木薯块根总生氰糖苷去除率达到97.902%。甜木薯是木薯种类之一，其生氰糖苷含量极低，所以可供人安全食用，但它不耐贮藏，保质期较短，加工成发酵酒后却易于保存。COLEHOUR A M等[4]发现了厄瓜多尔亚马逊地区的本土人每天都食用木薯酒；黄发新等[5]以粗木薯粉为原料，以米曲霉作液化剂、黑曲霉作糖化剂及酒母作发酵剂酿造木薯白酒；古碧等[6]以非即食型食用的木薯全粉为原料加甜酒曲酿造风味独特的甜酒。这些都有力说明酿造甜木薯酒具有可行性。甜木薯发酵酒是主要通过新鲜甜木薯加酒曲直接酿造而成的生物发酵产品，富有甜味或半甜味，其含有的营养成分和微量代谢物质与其发酵过程中产生的特殊风味物质密切相关。

在发酵过程中，甜木薯酒中的微生物通过代谢作用产生酸、醇、酯等香气物质。其中有机酸是甜木薯酒的重要呈味物质，直接影响酒的口感品质。然而目前国内乃至国际上有关木薯酒的有机酸等方面研究少见报道。但其他甘薯酒的有机酸等方面研究较多，如HAN X等[7]以冀紫薯1号为原料酿造紫甘薯红酒。研究结果表明，当料液比为1∶3（g∶mL），紫薯经液化、糖化和加酵母菌发酵，在23℃、pH 4.0的条件下发酵7 d后的紫甘薯红酒中含有L-苹果酸、酒石酸和琥珀酸等9种有机酸。

本研究以新鲜甜木薯为原料，采用甜酒曲液化糖化、发酵成木薯酒的方法，对酒中还原糖含量、酒精度、pH值及总酸含量的变化趋势进行研究，且利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析木薯酒发酵期间的主要有机酸种类及含量的动态变化，进而探讨木薯酒酸味味道强度和味感特性。以期有利于木薯资源的开发和利用，并为木薯酒风味物质的相关研究奠定理论基础，进一步促进酒业市场的繁荣。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白肉甜木薯：海南省海口市的木薯基地；广西香蜜甜酒粉：南宁广龙工贸有限责任公司。

丙酮酸（纯度98.0%）、琥珀酸（纯度99.0%）、L-酒石酸（纯度99.5%）：美国Sigma公司；草酸（纯度≥98.0%）、L-苹果酸（纯度≥98.0%）、柠檬酸（纯度≥98.0%）：中国食品药品检定研究院；乙酸（纯度≥99.7%）、乳酸（纯度≥98.0%）、磷酸二氢钾（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（色谱纯）：美国天地有限公司；磷酸（色谱纯）：上海长哲生物科技有限公司。其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度计：上海市元析仪器有限公司；Allegra X-12R冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司；Waters e2695高效液相色谱：美国waters公司。

1.3 方法

1.3.1 木薯酒加工工艺流程及操作要点

新鲜甜木薯→清洗→去皮→切片→蒸煮→冷却→加水打浆→拌曲发酵→过滤→高温杀菌→成品

操作要点：新鲜甜木薯原料要求无虫害、无霉变，清洗干净，削皮，切成8～10 mm厚度的块状，常压蒸煮至熟而不烂，蒸煮后冷却至常温，加水进行打浆，配制成50%熟木薯打浆液，再以550∶0.5的质量比例放入甜酒曲并搅拌，严格控制发酵温度为30℃，发酵时间为84 h，每12 h取3个平行酒样，且酒样于10 000 r/min条件下离心20 min，取上层清液置于-85℃超低温冰箱储存，待测其还原糖、酒精度、pH、总酸及有机酸含量。发酵期间，前2 d微生物生长旺盛，产生大量的CO2，应及时排气。以木薯酒中还原糖含量和酒精度不再变化时，结束发酵。

1.3.2 分析检测

木薯酒的还原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[8]；酒精度的测定采用国标GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》；pH值：pH值测定采用酸度计；总酸含量的测定采用国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的指示剂法；有机酸含量的测定采用高效液相色谱法，具体色谱条件如下：Agilent TC C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为甲醇，流动相B 0.02 mo1/L KH2PO4溶液（用H3PO4调pH至2.7），且流动相A/B（2∶98，V/V）；液相条件为等梯度洗脱20 min，流速为1 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL，检测波长为210 nm。

准确称取丙酮酸标准品15.000 mg，用超纯水溶解并定容到10 mL容量瓶中，摇匀，配制1.5 mg/mL的丙酮酸标准溶液。以相同的方法依次配制草酸、L-酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸与琥珀酸的标准溶液。然后将以上各标准溶液配制混标，4℃冷藏保存。以混标质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制有机酸标准曲线，按照有机酸出峰时间及标准曲线回归方程分别对样品中的有机酸进行定性定量分析。

1.3.3 数据统计与分析

实验中的检测分析包括木薯酒的还原糖、酒精度、pH、总酸和有机酸种类及含量。所有线性方程、重复性和准确性实验的样品数据均由Excel 2010计算得出，样品处理后的所有数据均以平均值±标准差的形式表示，且每个数据点3个重复，并用Origin86与SPSS16.0软件对所有数据进行统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中还原糖变化规律

酒糖度可反映其甜味，发酵过程中的酒甜味变化对口感会产生一定的影响。香蜜甜酒曲含有根霉和酵母两种微生物。由于微生物能利用的可发酵性糖大都是还原糖和低聚糖，木薯酒中还原糖含量变化过程如图1所示。

图1 不同发酵时间的木薯酒还原糖含量变化Fig.1 Changes of reducing sugar contents in cassava wine at different fermentation time

在发酵过程中，复杂碳水化合物降解产生的还原糖不仅能给予酒甜味，同时也是微生物的营养物质。从图1可看出，发酵24 h期间，酒中的还原糖含量随发酵时间延长而快速增加，24 h时达到还原糖含量的最高峰。发酵24 h后的还原糖含量先快速下降后降低趋缓，最终减少至54.67 mg/mL。与LUO H等[9]研究白酒中的微生物生态因子动力学的结果相似。结果表明，发酵前期，由于霉菌的糖化作用极为旺盛，白酒中的还原糖含量一直上升。随着发酵进行，酵母菌等微生物繁殖速率较快，消耗大量还原糖，使还原糖又呈下降趋势。因此木薯酒中还原糖的降低，可能由于产酸菌、产酯菌等微生物将可发酵性的糖类用于自身生长及代谢。但木薯酒中的糖分并非全部转化为酒精，总有一部分糖残留，给予酒体甜润和稠厚感。

2.2 发酵过程中酒精度变化规律

酒中的醇类物质是由霉菌、酵母和细菌等微生物利用糖、氨基酸及脂肪等成分而生成的主要代谢产物，包括一元醇、多元醇和芳香醇[10]。其中酒精是酒发酵的主要产物，其生成量的多少是鉴定出酒质量的主要指标，也是判断发酵是否正常的重要依据。木薯酒中酒精度变化过程如图2所示。

由图2可知，在发酵前12 h，木薯酒中酒精度增长缓慢，在发酵12～36 h时迅速上升。这主要由于在发酵初期，微生物的增殖速率较慢，对酒中可发酵性糖类的利用率较低。随着发酵进行，酒中的可发酵性糖浓度升高，使微生物能利用糖类进行酒精发酵，从而产生大量酒精。但在后发酵期间，酒中还原糖含量逐渐减少，再加上发酵产物酒精抑制微生物的增殖，所以酒精度在36～84 h先缓慢上升后平稳在7.11%vol。说明大量微生物在发酵60～84 h处于衰老阶段，此时发酵基本结束。

图2 不同发酵时间的木薯酒酒精度变化Fig.2 Changes of alcohol contents in cassava wine at different fermentation time

2.3 发酵过程中pH值与总酸含量的变化规律

酒pH值与总酸含量有密切的联系，且总酸含量可反映其酸味，发酵过程中的木薯酒酸度变化也会对口感产生一定的影响。根霉能产生糖化酶，将淀粉水解成还原糖及低聚糖类等以及少量的有机酸[11-12]。在厌氧环境下，酵母菌利用根霉糖化淀粉所产生的糖类酵解为酒精和酸[12]。木薯酒的pH值及总酸含量变化过程如图3所示。

图3 不同发酵时间木薯酒pH值与总酸含量变化Fig.3 Changes of pH and total acid contents in cassava wine at different fermentation time

由图3可知，在0～84 h的发酵过程中，木薯酒的总酸趋势先缓慢降低再缓慢增加，后快速增加，与pH值变化趋势相反。可能因为发酵初期微生物繁殖所需能源和碳源物质不足，导致有机酸被消耗利用。到12 h后的木薯酒中微生物增殖速率快，从而产生有机酸。发酵后期发酵产生的酒精又被氧化成有机酸，从而引起总酸含量的增加。因此，在发酵过程中应控制微生物的代谢作用，调节总酸的生成量，保证木薯酒产品的质量稳定。

2.4 发酵过程中的有机酸组分及含量分析

2.4.1 有机酸标准曲线

按照色谱条件，8种有机酸的分离效果较好（见图4）。以各标准有机酸质量浓度（x）对峰面积（y）进行线性回归，结果见表1。由表1可知，各有机酸标准曲线相关系数R2均≥0.996，表明二者线性关系良好。

图4 有机酸混合标准品的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of organic acids mixed standards

表1 8种有机酸标准品标准曲线回归分析Table 1 Regression analysis of standard curves of eight organic acids standards

2.4.2 发酵前后的有机酸组分和含量分析

传统木薯酒的有机酸部分来源于木薯本身，另一部分来源于酒精发酵、乙酸或苹果酸-乳酸发酵。通过HPLC对酒发酵期间包括乳酸、乙酸、柠檬酸在内的8种有机酸进行分析，采用外标法测定其有机酸种类及含量，其动态变化的研究结果见表2。

表2 木薯酒发酵过程中的有机酸组成及动态变化Table 2 Composition and dynamic changes of organic acids in fermentation process of cassava wine mg/mL

木薯原料的成熟程度会引起酒的有机酸组成和含量变化。通常有机酸是在木薯生长过程中积累，在成熟过程中作为糖酵解、三羧酸循环等呼吸基质以及糖原异生作用基质而被消耗[13]。从表2可看出，乳酸、乙酸、琥珀酸和柠檬酸是新鲜木薯的主体有机酸，其中乳酸含量最高。与李姗姗等[14]的研究结果类似，从木薯块根经乙醇提取后的化学物质的波谱分析表明：木薯块根含有乳酸和琥珀酸。PICHADH等[15]采用HPLC分析生、熟甘薯块根中的有机酸，研究表明生、熟甘薯有机酸均以苹果酸、柠檬酸和琥珀酸为主，少量含有草酸。

发酵过程中微生物的代谢也会引起酒的有机酸组成和含量变化。表2结果表明，木薯酒有机酸种类丰富，且随着发酵菌种生长与代谢而发生改变。在发酵期间，酒石酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸是木薯酒中有机酸的重要组成部分，其中主要有机酸为乳酸，这可能是由于木薯酒在发酵过程中以同型或异型乳酸发酵为主，大部分葡萄糖转化为乳酸的结果[16]。草酸、丙酮酸、苹果酸等含量相对较少，是酒中的辅助酸味有机酸，这形成了传统木薯酒丰富的酸味味感。发酵后期木薯酒中的苹果酸含量逐渐降低，可能因为酒通过三羧酸循环合成，产生苹果酸、柠檬酸，苹果酸通过苹果酸-乳酸发酵又被转化成酒精或乳酸。与赵鹤然[17]研究葡萄酒发酵过程中的苹果酸变化结果一致。DRIEHUIS F等[18]发现乳酸菌在厌氧条件下具有降解乳酸转化为乙酸的能力。而乙酸是木薯酒中挥发性有机酸的主要成分，含量少时带有愉快的醋香味。木薯中的谷氨酸由于其降解代谢，使木薯酒中的琥珀酸积累。TSUJI A等[19]研究表明丙酮酸、柠檬酸及琥珀酸是碳代谢的中心物质。

2.5 有机酸的酸味特性分析

酒中有机酸的种类、含量及构成受原料、酒曲、酿造条件等多种因素影响[20]，对酒的风味有很大影响。酒利用酒曲中的微生物进行恒温发酵，会产生多种酸味物质，但对酸味起主要作用的是酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸。代谢产物乳酸、乙酸等有机酸对木薯酒的风味影响显著，且比例协调地抑制酒发酵过程中的杂菌生长，增强酒的醇厚感，促进芳香酯的形成。基于酸的浓度和酸味之间并不呈现一种简单的相互关系[21]，本研究参考酒类产品有机酸的阈值[22-23]（见表3）并结合味道强度值taste active value，TAV）（TAV值为样品中呈味有机酸在样品中的含量与其对应的呈味阈值之比。）分析法对木薯酒中呈味有机酸的呈味贡献进行分析不同发酵时间的样品各呈味有机酸TAV分析见表4。

表3 7种呈味有机酸阈值与酸味特性Table 3 Threshold value and sour taste characteristics of seven kinds of taste organic acids

表4 不同发酵时间的有机酸味道强度值分析Table 4 TAV analysis of organic acids with different fermentation time

不同有机酸对酒中风味贡献不同。由表4可知，在发酵期间，酒中丙酮酸的TAV值始终＜0.5，风味不显著；TAV值＞2的是乳酸、柠檬酸、乙酸和琥珀酸，表明乳酸、柠檬酸、乙酸和琥珀酸是影响传统木薯酒口感的重要有机酸。酒石酸、苹果酸作为酒的辅助酸味特征成分。

发酵84h的木薯酒有最高的味道强度，发酵12h样品最低。影响木薯酒酸味特性的主要是乳酸和乙酸，还有独特的柠檬酸。在发酵期间，木薯酒中的七种呈味有机酸总含量变化与总味道强度变化趋势一致，其中乳酸的含量变化趋势也与之一样，这说明发酵过程中各有机酸的消长影响酒的味道强度，尤其乳酸的消长。虽然TAV值这一概念没有考虑到某些成分的协同作用或抵消作用对酒中风味的影响，仍有一定的局限性，但TAV值仍不失为酿造者评价其产品和生产方法的有用参考依据[23]。

2.6 统计分析

2.6.1 相关性分析

对不同发酵时间的木薯酒各呈味有机酸量之间，呈味有机酸量与总味道强度进行Pearson法相关分析，结果见表5。由表5可知，乳酸与乙酸变化呈显著正相关（P＜0.01），琥珀酸与酒石酸变化具有显著的负相关（P＜0.05），总味道强度与乳酸、乙酸变化呈显著正相关（P＜0.05）。

表5 发酵过程中的各呈味有机酸与总味道强度的相关性分析Table 5 Correlation analysis of taste organic acids and total taste intensity during fermentation process

2.6.2 聚类分析

对不同发酵时间的木薯酒各呈味有机酸味感贡献进行聚类分析，结果见图5。由图5可知，其中1～6分别代表发酵时间为0、12 h、24 h、36 h、60 h和84 h。根据发酵时间，可以将呈味有机酸聚类为3类。即第1类：0、12 h，第2类：24 h、36 h，第3类：60 h、84 h。聚类分析的结果代表着在不同发酵时间，呈味有机酸量及总味感强度的变化趋势一致，皆是先缓慢增加，后快速增加再呈趋缓的总趋势。

图5 发酵不同时间的各呈味有机酸与总味道强度的聚类分析Fig.5 Cluster analysis of taste organic acids and total taste intensity with different fermentation time

3 结论

本研究以新鲜甜木薯为原料，经香蜜甜酒曲通过短时间发酵而酿造木薯酒产品，对发酵过程中酒品质进行动态跟踪及分析。研究发现：在发酵期间，木薯酒还原糖先快速增加至最高点然后降低趋缓，最终减少至54.67 mg/mL。酒精度先上升后平稳在7.11%vol。总酸含量先缓慢降低至2.21 mg/mL，再缓慢上升，后快速上升，与pH值变化趋势相反。本研究通过甜酒曲发酵木薯酒的品质分析，为木薯酒的酿造、加工提供一定的参考价值。

本研究采用HPLC分析木薯酒发酵期间的有机酸。研究表明：乳酸、乙酸、琥珀酸和柠檬酸是新鲜木薯的主体有机酸，其中乳酸含量最高，达到1.925 mg/mL。在发酵期间，酒石酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸是木薯酒中有机酸的重要组成部分，分别占木薯酒总有机酸含量的2.664%～12.306%，41.503%～63.527%，18.208%～23.819%，1.220%～27.766%，3.165%～15.889%，草酸、丙酮酸、苹果酸等含量相对较少，是酒中的辅助酸味特征成分，这形成了木薯酒丰富的酸味味感。在酸味味感强度分析中，乳酸和乙酸是木薯酒的主体酸，发酵期间其TAV值占总TAV值为65.824%～95.835%，影响酒的酸味特性，赋予木薯酒一定的酸味。其中发酵84 h的木薯酒有最高的TAV值，其可达到223.865。本研究为进一步开发发酵酒功能性产品提供实验依据。

本研究通过木薯酒发酵过程中还原糖、酒精度、pH值、总酸及有机酸等动态变化，以把握发酵过程中主要有机酸的演变规律，为木薯酒品质影响的研究奠定基础。后续的研究应对酒中香气成分、多酚物质的变化规律进行分析，进一步研究木薯酒的香品质与抗氧化特性变化，最终实现发酵木薯酒的现代化生产工艺。

[1]李一鲲.关于开发木薯生产的认识与建议[J].云南农业科技，1998（1）：11-14.

[2]唐德富，IJI P，CHOCT M，等.木薯产品营养成分的分析与比较研究[J].中国畜牧兽医，2014，41（9）：74-80.

[3]SAKA J D K,NYIRENDA K K.Effect of two ethnic processing technologies on reduction and composition of total and non-glucosidic cyanogens in cassava[J].Food Chem,2012,130(3):605-609.

[4]COLEHOUR A M,MEADOW J F,LIEBERT M A,et al.Local domestication of lactic acid bacteria via cassava beer fermentation[J].Peer J,2014,8(2):e479-e479.

[5]黄发新，徐中文，黄勇然，等.木薯酒的研究[J].中国酿造，1996，15（1）：15-19.

[6]古 碧，谢彩锋，李 凯，等.一种木薯全粉甜酒的制作方法：CN 105349317A[P].2016-02-24.

[7]HAN X,MOU D,ZHAO Y,et al.Optimization of fermentation conditions for purple sweet potato red wine and its chemical analysis[J].Food Sci,2015,36(17):201-206.

[8]ZHAO K,XUE P J,GUANG-YE G U.Study on determination of reducing sugar content using 3,5-dinitrosalicylic acid method[J].Food Sci,2008,29(8):534-536.

[9]LUO H,LIU S,TIAN W,et al.Dynamic analysis of microbial ecological factors in the fermentation pit of Luzhou-flavor Chinese liquor[J].China Brewing,2011,30(7):108-112.

[10]沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社，1998：10.

[11]喻凤香，林亲录.甜酒酒曲根霉淀粉酶研究进展[J].中国食物与营养，2005（4）：25-28.

[12]蒋 鹏.用纯根霉，酵母制作甜米酒[J].生物学通报，1997（1）：38-38.

[13]CHEN F X,LIU X H,CHEN L S.Advances in research on organic acid metabolism in fruits[J].Journal of Fruit Science,2005,22(5):526-531.

[14]李姗姗.木薯次生代谢产物及其生物活性研究[D].海口：海南大学,2012.

[15]PICHA D H.Organic acid determination in sweet potatoes by HPLC[J].J Agr Food Chem,1985,33(4):743-745.

[16]刘 璞,吴祖芳，翁佩芳.榨菜腌制品风味研究进展[J].食品研究与开发，2006，27（1）：158-161.

[17]赵鹤然.葡萄酒酿造过程中的苹果酸和乳酸的变化[D].大连：大连工业大学，2016.

[18]DRIEHUIS F,ELFERINK S J W H O,SPOELSTRA S F.Anaerobic lactate degradation in maize silage inoculated withLactobacillus buchneriinhibits yeast growth and improves aerobic stability[J].J Appl Microbiol,1999,87(4):583-594.

[19]TSUJI A,OKADA S,HOLS P,et al.Metabolic engineering ofLactobacillus plantarumfor succinic acid production through activation of the reductive branch of the tricarboxylic acid cycle[J].Enzyme Microb Technol,2013,53(2):97-103.

[20]CAI H,ZHANG T,ZHANG Q,et al.Microbial diversity and chemical analysis of the starters used in traditional Chinese sweet rice wine[J].Food Microbiol,2018,73:319-326.

[21]丁耐克.食品风味化学[M].北京：中国轻工业出版社，1996：64-65.

[22]董 霞.啤酒中有机酸类物质的研究[D].无锡：江南大学，2004.

[23]YANG Y M,YANG P Y,WANG X R.Electronic nose based on SAWS array and its odor identification capability[J].Sensors＆amp;Actuators B Chemical,2000,66（1-3）：167-170.