菌株F21来源α-淀粉酶的酶学性质研究1

郭宏文1，2，徐婷婷1，2，刘晓兰1，2，姜未公1，马瑞1

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

在酶制剂工业中，α-淀粉酶是最早实现工业化生产且用途最广、产量最大的酶制剂品种，几乎占淀粉酶制剂总产量的50%以上[1]。通常，中性α-淀粉酶的最适pH范围为6.0～8.0，而酸性α-淀粉酶最适pH范围为4.0～6.0。与中性α-淀粉酶相比，酸性α-淀粉酶能够在酸性条件下水解淀粉，保持高活性。凭借它的优势，酸性α-淀粉酶在食品加工、酿造发酵、制糖、纺织、造纸、医药和饲料等工业领域的应用日益广泛[2-4]。目前工业应用的α-淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌[5-6]，生产酸性α-淀粉酶的菌株则主要为黑曲霉和枯草芽孢杆菌[7-8]。研究和开发新型的酸性α-淀粉酶具有极高的社会经济价值。近年来，国内学者在开发新型的酸性α-淀粉酶方面开展了一些研究，如屈建航等[9]筛选到产α-淀粉酶的酵母菌菌株SH3，所产α-淀粉酶的最适pH值为5.0，最适温度为50℃。权淑静等[10]对黑曲霉菌株A-5-3所产α-淀粉酶进行了酶性质研究，酶的最适pH值为3.6，最适温度为70℃，具有很好的酸稳定性且为非Ca2+依赖型水解酶。本研究对实验室从白酒厂的酒醅中分离筛选的产α-淀粉酶菌株F21进行诱变选育[11]，并对其所产的α-淀粉酶进行纯化和酶学性质研究，为开发新型的酸性α-淀粉酶在酶的纯化方面提供一些基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）F21：本实验室从酒醅中分离并经诱变选育得到。

1.1.2 培养基[12]

菌种保藏培养基：可溶性淀粉1.2 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，琼脂粉2.0 g，蒸馏水100 mL，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

产酶种子培养基：可溶性淀粉1.2 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO·47H2O 0.05 g，蒸馏水100 mL，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

产酶发酵培养基：玉米淀粉2.0 g，豆饼粉1.5 g，K2HPO40.1 g，MgSO·47H2O 0.05 g，蒸馏水100 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂

快速辛基-琼脂糖凝胶（OctylSepharoseFastFlow）填料：美国Amersham Biosciences公司；硫酸铵（色谱纯）：生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器公司；HYG-III回转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备公司；CR21GⅢ日立高速冷冻离心机：天美（中国）科学仪器有限公司；AKTAPrime蛋白纯化系统：美国GE公司；Octyl-Sepharose Fast Flow层析柱（1.6 cm×20 cm）：上海锦华层析设备厂。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制备

菌株的活化：将菌种接种到斜面培养基，在37℃的培养箱中培养24 h。

种子液制备：活化后的菌种接入装有25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于36℃、180 r/min条件下的摇床中培养18 h。

发酵液制备：取2.4mL种子液接种到装有30mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在40℃，200 r/min的摇床中培养48 h。

粗酶液制备：发酵液经四层纱布过滤后，在8 000 r/min条件下离心20 min，取上清液备用。

1.3.2 蛋白含量的测定

参见Folin-酚试剂法（Lowry法）[13]测定蛋白含量。

1.3.3α-淀粉酶活测定

参见YOO J Y等[14-15]的方法测定α-淀粉酶活。

α-淀粉酶活定义：在pH 4.6、温度60℃条件下，5 min水解1mg可溶性淀粉（0.5%）所需的酶量为一个活力单位（U）。

相对酶活：酶活与相同反应条件下酶活最大值的比值（%）。

酶比活力：酶活与蛋白浓度的比值，用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示（U/mg）。

1.3.4 硫酸铵盐析

将5 mL上清液装入离心管中，在4℃条件下，分别缓慢加入饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸铵，4℃静置过夜，经10 000 r/min冷冻离心20 min后，收集各管中的沉淀，测定不同硫酸铵饱和度条件下对应的蛋白浓度和α-淀粉酶活，绘制盐析曲线[16]。

1.3.5 Octyl-Sepharose Fast Flow柱层析

色谱方法及条件：平衡液为饱和度40%的硫酸铵溶液；洗脱液使用0.02 mol/L pH7.0磷酸缓冲液（phosphatic buffer solution，PBS）；流速为2mL/min；上样量为15mL。样品上样后先用120 mL饱和度为40%的硫酸铵冲洗，然后用120 mL饱和度为40%的硫酸铵和等体积的0.02 mol/L pH7.0 PBS进行梯度洗脱（洗脱液中硫酸铵饱和度40%～0%），最后用0.02 mol/LpH 7.0 PBS洗脱，用自动部分收集器定时收集3 mL/管，检测各管收集液的蛋白吸光度值及α-淀粉酶活，收集酶活高的洗脱液[16]。

1.3.6 酶学性质研究

最适反应pH：采用pH为3.5～10.5的不同缓冲液配制反应体系，于55℃条件反应，并计算相对酶活力。

最适反应温度：酶反应体系于35～90℃条件下进行反应，并计算相对酶活力。

pH稳定性：酶液分别在不同pH（3.5～10.5）条件下处理1 h后进行酶反应，测定相对酶活。

温度稳定性：酶液分别在不同温度（35～90℃）条件下处理1 h后进行酶反应，测定相对酶活。

不同金属离子对酶活的影响：酶反应体系中添加0.5 mmol/L不同种类的金属离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））后，于最适pH和温度条件下进行酶反应，测定相对酶活。

1.3.7 数据处理

实验数据均为3次平行实验结果的平均值，图利用Excel软件进行数据处理得到。

2 结果

2.1 硫酸铵盐析

采用不同饱和度的硫酸铵对粗酶液进行盐析，测定硫酸铵沉淀中的蛋白浓度及酶活，制作盐析曲线，结果如图1所示。

图1 硫酸铵盐析曲线Fig.1 The curve of ammonium sulfate fractionation

由图1可知，硫酸铵饱和度低于40%时，目的酶蛋白沉淀的量很少，饱和度在40%～60%时，目的酶蛋白随硫酸铵量的增加开始大量析出，酶活同时迅速增大。当饱和度超过60%时，目的酶蛋白的析出量增加很少，酶活增加很小，而杂蛋白仍大量析出。硫酸铵饱和度为50%、60%和70%时酶活分别为804.7 U/mL、1 053.2 U/mL和1 115.5 U/mL。计算了各饱和度目的酶蛋白的比活力，50%饱和度的比活力为1 826.7，60%饱和度的比活力为1 617.6，70%饱和度的比活力1 173.0。综合考虑比活力及酶活，为了达到较好纯化效果而又减少酶活的损失。因此，选择使用60%饱和度的硫酸铵对发酵液进行盐析以沉淀回收目的酶蛋白。

2.2 Octyl-Sepharose Fast Flow柱层析

测定不同收集液的OD280nm值和酶活，制作疏水层析曲线，结果如图2所示。

图2 Octyl-Sepharose F F疏水层析曲线Fig.2 The elution curve of Octyl-Sepharose Fast Flow Hydrophobic chromatography

由图2可知，共出现三个蛋白峰，第一个峰在冲冼的阶段，是没有被疏水分离介质吸附上的蛋白质，峰值最大，OD280nm值为1.565，蛋白量最多。第二个峰在梯度洗脱过程中出现，是吸附在分离介质上的被一定浓度的PBS洗脱下来的部分蛋白，其峰值小，OD280nm值为0.432，蛋白含量少。第三个峰出现在用无硫酸铵的PBS冲洗的阶段，峰值最小，是吸附在分离介质上的结合力最强的少量蛋白。分别测定这三个蛋白峰对应的各管酶活，仅第一个峰有酶活，活性峰与蛋白峰几乎重合。说明酶没能被分离介质所吸附，在第一阶段被缓冲液洗下。而第二、第三个峰的蛋白均无酶活，属于杂蛋白峰。通过本次疏水层析达到了一定的纯化效果，去除了酶液中被疏水分离介质吸附的杂蛋白。

2.3 α-淀粉酶纯化结果

粗酶液、60%饱和度的硫酸铵对发酵液进行盐析沉淀后用蒸馏水溶解及Octyl-Sepharose Fast Flow柱层析洗脱液中各指标的测定结果见表1。

表1 a-淀粉酶的纯化结果Table 1 Purification results of α-amylase

2.4 酶学性质研究

2.4.1 酶反应最适pH及pH稳定性

不同pH对酶活的影响及pH稳定性结果见图3。由图3可知，酶在pH4.8时反应的活力最大，酶反应的最适pH值为4.8，在酸性条件pH 4.5～6.0范围内酶反应活力较高，相对酶活在75%以上。在中性条件pH 7.0条件下，相对酶活为66.2%，在碱性条件酶反应仍保持较高的活力，pH 9.0时的相对酶活为60.9%，pH10时的相对酶活为53.9%。结果表明，酶在pH 4.0～9.0的范围内相对稳定，相对酶活保持在90%以上，且在酸性环境pH 4.5条件下最为稳定。酶在pH 4.0条件下的相对酶活为91.8%，pH5.0条件下的相对酶活为98.2%，可见，该酶具有较好的耐酸性。

图3 反应pH对酶活性的影响及酶的pH稳定性Fig.3 Effect of reaction pH on enzyme activity and pH stability of enzyme

2.4.2 酶反应最适温度及热稳定性

不同反应温度对酶活的影响及酶的热稳定性结果见图4。由图4可知，酶反应温度为55℃时的活力最大，酶反应的最适温度为55℃。酶在50～65℃范围内反应具有较高活力，相对酶活在90%以上。当温度大于75℃时酶活急剧下降，75℃酶反应时的相对酶活为76.9%，90℃酶反应时的相对酶活只有44.1%。酶的热稳定性研究结果为，酶在35℃条件下最稳定，在温度低于45℃的条件下比较稳定，活力保持在35℃时酶活的90%以上，在高于60℃的条件下酶迅速失活，60℃条件下的残余酶活为65.5%，75℃条件下的残余酶活只有8.9%。

图4 反应温度对酶活性的影响及酶的热稳定性Fig.4 Effect reaction temperature of enzyme activity and temperature stability

2.4.3 金属离子对酶活的影响

以不添加金属离子时的酶活为对照，金属离子对酶活的影响结果见图5。由图5可知，Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+对酶活有激活作用，其中Ca2+对酶的活性激活作用较强，活力比对照提高了17.8%。其余金属离子对酶的活性有一定的抑制作用，其中Fe2+和Fe3+的抑制作用较强，活力只为对照的88.2%和89.2%。

图5 不同金属离子对酶活的影响Fig.5 Effect of different metal ions on enzyme activity

3 结论

本研究采用硫酸铵盐析和疏水作用层析对菌株F21所产的α-淀粉酶粗酶液进行纯化并对其进行酶学性质研究。研究发现，该α-淀粉酶反应的最适温度为55℃，最适pH值为4.8，属于一种中温酸性α-淀粉酶。酶在pH 4.0～9.0及低于45℃的环境下比较稳定。Ca2+对酶的活性有较强的激活作用，Fe2+及Fe3+对酶的活性有较强的抑制作用。该α-淀粉酶对钙离子有依赖性，这与文献报道的多种酸性α-淀粉酶的特点是一致的。该α-淀粉酶稳定存在的pH范围广范，具有较好耐酸性的同时，在中性及偏碱性条件下也比较稳定，且在中性及偏碱性条件下的酶活仍保持在酸性条件下酶活的60%以上，使该酶具有一定的研究开发价值。

[1]孟宪梅，杜 承，秦亚楠.耐高温α-淀粉酶的分子生物学研究进展[J].吉林工商学院学报，2010，26（5）：41-43.

[2]Reddy N S，Nimmagadda A，Sambasiva Rao K R S.An overview of the microbial α-amylase family[J].Afr J Biotechnol.2003，2（12）：645-648.

[3]Kalpana Bandian S K.Halotolerant，acid-alkali stable，chelator resistant and raw starch digesting α-amylase from a marine bacterium Bacillus subtilis S8-18[J].J Basic Microbiol，2014，54（8）：802-811.

[4]贾冬梅，华晓曼，王玉华.耐酸性α-淀粉酶研究进展[J].食品科技，2016，41（10）：224-227.

[5]Gupta R，Gigras P，Mohapatra H，et al.Microbial α-amylases：a biotechnologicalperspective[J].ProcessBiochemistry，2003，38（11）：1599-1616.

[6]李 松，王正祥.真菌α-淀粉酶的研究进展[J].生物技术通报，2011，27（3）：66-70.

[7]Sharma A，Satyanarayana T.Microbial acid-stable α-amylases：Characteristics，genetic engineering and applications[J].Process Biochem，2013，48（2）：201-211.

[8]石方方，焦国宝，丁长河，等.耐酸耐高温α-淀粉酶的研究进展[J].中国食品添加剂，2014，（4）：171-176.

[9]屈建航，尹 伊，焦国宝，等.酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究[J].生物技术通报，2015，31（7）：188-192.

[10]权淑静，解复红，马 焕，等.一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选及酶学性质研究[J].中国酿造，2014，33（5）：104-108.

[11]郭宏文，王 艳，江成英，等.酸性α-淀粉酶菌种的诱变选育[J].江苏农业科学，2016，44（3）：356-357.

[12]郭宏文，江成英，王 路，等.酸性α-淀粉酶菌种产酶条件的优化[J].江苏农业科学，2017，45（21）：308-310.

[13]张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，2002：137-138.

[14]Yoo Y J，Hong J，Hatch R T.Comparison of α-amylase activities from different assay methods[J].Biotechnology and Bioengineering，1987，30（11）：147-151.

[15]史永昶，姜涌明，樊 飚，等.蛋白酶对解粉芽孢杆菌α-淀粉酶活力的影响[J].微生物学通报，1995，22（1）：23-25.

[16]江成英，吴耘红.生物工程实验原理与技术[M].大连：大连理工大学出版社，2013：331-346.