高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定平肺口服液中五味子醇甲的含量

肖宏华 ，马长华 ，马秉智 ，孙 磊

（1.北京市朝阳区食品药品安全监控中心，北京 100023；2.北京中医药大学中药学院，北京 102488；3.中日友好医院 药学部，北京 100029；4.中国食品药品检定研究院，北京 100050）

平肺口服液为中日友好医院制剂，清肺化痰止咳、解毒散结、止血，用于肺部肿瘤引起的胸痛、咳痰、咳血等症。处方由浙贝母、鱼腥草、五味子、白及等十味药组成。其中五味子为该处方中主要药味，五味子醇甲为五味子中主要有效成分。为更好的控制产品质量，保证临床疗效，本文参照《中国药典》[1]及相关文献[2～6]，建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）测定平肺口服液中五味子醇甲的含量，为其质量控制提供参考。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪 （DAD检测器，二元泵，OpenLAB色谱数据处理系统）；Waters Sunfire C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；XS-205 DU 型 1/10 万电子天平（METTLER-TOLEDO）；明澈 TM-D 24 UV 纯水/超纯水系统（Merck Millipore）。

五味子醇甲（批号110857-201714，含量以99.9%计）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯（Fisher Chemical）；水为超纯水（自制）；平肺口服液（中日友好医院中药制剂室生产，批号分别为20160509、20170412、20170628、20170818）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters Sunfire C18 色谱柱 （4.6mm×250mm，5μm）；乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，按表1进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长 216nm，光谱范围：190.0～400.0nm，步进值1.0nm，柱温35℃，进样量：对照品溶液5μl、供试品溶液 20μl、阴性对照溶液 20μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取五味子醇甲对照品11.52mg，置100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（115.08mg/L）。精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（23.02mg/L）。

表1 流动相梯度条件

2.3 供试品溶液的制备

取本品5支，将内容物倒入同一具塞锥形瓶中，摇匀。精密量取2ml，置10ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

依据平肺口服液的处方及制法，制备缺五味子的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5 专属性考察

图1 平肺口服液HPLC色谱图

图2 对照品色谱峰与供试品色谱峰光谱图

分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示在五味子醇甲对照品色谱峰相应保留时间处，阴性对照溶液色谱中没有对应的色谱峰，说明阴性样品对待测组分无干扰。在供试品色谱中待测组分与其他组分分离度＞1.5，得到很好的分离，色谱图见图1。利用OpenLAB色谱数据处理软件的光谱功能，分析供试品色谱中在与对照品色谱峰相应保留时间处的色谱峰的光谱图，结果与对照品色谱峰的光谱图一致，并对该色谱峰进行纯度检测，纯度因子为999.6，表明该方法专属性良好，光谱图见图2。

2.6 线性关系考察

精 密 量 取 对 照 品 储 备 液 （115.08mg/L）1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml分别置 10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X），进行线性回归，回归方程为 Y=30.43X+3.873，r=1（n=5）。结果表明，五味子醇甲浓度在11.51～69.11mg/L范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.7 重复性试验

表2 平肺口服液加样回收率试验（n=9）

图3 不同仪器的供试品HPLC色谱图

取对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，结果峰面积RSD为 0.13%，表明仪器重复性良好。取供试品按“2.3”项下方法平行制备6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算五味子醇甲含量，结果平均含量为23.88mg/L，RSD为1.18%，表明方法的重复性良好。

2.8 稳定性试验

取供试品溶液，室温下分别于 0，2h、4，8h、12h、24h 按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果 RSD为 1.20%（n=6），表明供试品溶液在室温下24h内稳定。

2.9 加样回收率试验

精密量取已知含量的供试品2ml，置10ml量瓶中。制备9份，3份一组，分别加入含量50%、100%、150%的五味子醇甲对照品溶液，再加水稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按“2.1”项下色谱条件，进样10μl测定，计算加样回收率。结果见表2。

2.10 样品测定

取4批平肺口服液样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样10μl测定，五味子醇甲含量（mg/L）分别为 23.88、29.70、16.38 和 14.57。

2.11 耐用性考察

取同一供试品溶液，分别采用Agilent-1260-DAD型、Waters-e2695-2498UV型、SHIMADZU-2010AHT型 3台高效液相色谱仪进行测定，色谱图见图3。并且分别比较了Waters Sunfire C18色谱柱、Supleco Discovery C18色谱柱、Agilent ZORBAX Eclipse C18色谱柱，考察了不同柱温（30℃、35℃、40℃），除五味子醇甲保留时间略有变动外，其余均无明显差异。

3 讨论

3.1 提取溶剂与提取方法的选择

供试品溶液制备时，考察了水、甲醇、50%甲醇作为溶剂，甲醇、50%甲醇可以使样品溶液产生沉淀，去除一些杂质，但稀释过程中会放热，这就给定容造成误差。另外，比较了直接稀释法、乙酸乙酯萃取法、中性氧化铝吸附法的处理效果，结果表明采用水作为溶剂直接稀释，简便易行，可以达到很好的效果。

3.2 检测波长的选择

通过DAD检测器，在190.0～400.0nm波长范围内对五味子醇甲进行扫描，发现其在216nm和250nm波长处有最大吸收，且供试品色谱图在这两处波长下均无其他组分干扰，基线平稳，但是，在216nm波长处五味子醇甲有较高的响应值，故选择216nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液3种流动相系统的分离效果，结果表明当乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱时，所得色谱峰保留时间和峰面积最稳定，峰形最好，分离效果最佳。

3.4 平肺口服液含测成分的选取

平肺口服液处方中含有预知子、浙贝母、鱼腥草等众多药味，经过前期研究发现，五味子醇甲为《中国药典》中五味子质量控制指标[1]，在该制剂中含量较高，且化学性质相对稳定，故选择测定平肺口服液中五味子醇甲的含量，后续还将对其他成分进行含量测定研究，从而建立平肺口服液的质量控制方法。

3.5 样品测定结果分析

由样品测定结果可知，4批次平肺口服液中五味子醇甲含量存在明显的差异。究其原因，一方面可能与五味子药材质量有关，不同产地、不同的采收时间，五味子中五味子醇甲的含量有较大区别，五味子采收后，随着存储时间的延长，五味子中五味子醇甲的含量有降低的趋势[3]。另一方面可能与生产工艺、提取过程等环节有关，有待于进一步研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.66.

[2]禹洁，刘培勋，龙伟，等.五味子总木脂素的分离纯化与体外抗肿瘤活性的研究[J].中国药师，2009，12（12）：1718.

[3]黄文倩，李丽，肖永庆，等.HPLC同时测定五味子中6种木脂素类成分[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：63.

[4]胥爱丽，董玉娟.五味子配方颗粒的HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（2）：81.

[5]柯华香，李化，苏建春，等.南北五味子中木脂素类成分含量的比较[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（17）：40.

[6]周艳，祁英杰，闫小玉，等.北五味子及其不同炮制品中6种木脂素类成分的含量测定[J].中国中药杂志，2011，36（24）：3449.