1，25(OH)2D3对脂多糖诱导下肾小管上皮细胞增殖与凋亡的影响

史欣辉 陈建平 杨 阳 李 铭 杨晓萍

(石河子大学医学院第一附属医院肾内科，新疆 石河子 832000)

慢性肾脏病(CKD)在全球的发病率逐年升高〔1，2〕。在我国，CKD的知晓率、治疗率、控制率仍不容乐观，随着病情的进展，最终将导致终末期肾脏病，该病花费高，预后差。CKD的发病机制复杂，起病隐蔽，防治困难，因此，从CKD的发病机制出发寻找一种确实有效的方法具有重要意义〔3〕。活性维生素D3是一种类固醇激素，其在体内的活性形式为1，25(OH)2D3，其经典的生理作用为调节钙磷代谢。1，25(OH)2D3可以抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡〔4〕，抑制炎症反应〔5〕，同时其还能延缓大动脉重构与硬化〔6〕，保护血管内皮功能〔7,8〕。本研究旨在探讨1，25(OH)2D3对脂多糖诱导下人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞增殖与凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 HK-2细胞株购于湘雅医学院中心实验室，保持了正常的形态与功能。低糖细胞培养基(DMEM)、胰蛋白酶、细胞计数试剂盒(CCK)-8检测试剂盒、碘化丙啶(均为美国Sigma产品)、无支原体胎牛血清(杭州四季青产品)、AnnexinV-FITC凋亡试剂盒(美国 Invitrogen产品)。

1.2细胞培养与实验分组 HK-2 细胞进行传代培养，当生长至 80%～90%融合后，用无血清低糖DMEM培养液同步化24 h，分为正常对照组(加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液)、脂多糖组(正常对照基础上，加入脂多糖，使其终浓度为1 μg/ml)、1，25(OH)2D3〔正常对照基础上，加入1，25(OH)2D3，使其终浓度为10-8mol/L〕、脂多糖联合1，25(OH)2D3组〔先在正常对照基础上加入脂多糖，使其终浓度为1 μg/ml，干预培养4 h，然后在正常对照基础上加入1，25(OH)2D3，使其终浓度为10-8mol/L〕，均干预培养48 h。

1.3HK-2细胞增殖检测 细胞以2×105个/ml接种于96孔板内，200 μl/孔，干预培养48 h后严格按照CCK-8细胞增殖检测试剂盒操作，用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度值(A450 nm)，每个实验组设4个复孔，实验重复3次，并按以下公式计算细胞抑制率(IR)=(A对照组值-A实验组值)/(A对照组值)。

1.4HK-2细胞周期分布检测 细胞以5×105个/ml接种于6孔板内，2 ml/孔，干预培养48 h后，流式细胞仪检测细胞周期，并按以下公式计算细胞增殖指数(PI)=S期和G2期细胞比例之和/G1期、S期和G2期细胞比例之和。

1.5HK-2细胞凋亡检测 细胞以5×105个/ml接种于6孔板内，2 ml/孔，按照实验分组干预48 h后，严格按照AnnexinV-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡试剂盒操作步骤，用流式细胞仪检测HK-2细胞的凋亡，实验重复3次。

1.6统计学分析 采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析、LSD-t法和秩和检验。

2 结 果

2.1各组HK-2细胞增殖比较 与正常对照组比较，脂多糖组HK-2细胞吸光度值明显升高，细胞增殖明显增加(P<0.01)；1，25(OH)2D3组HK-2细胞吸光度值明显降低，细胞增殖明显抑制(P<0.01)。与脂多糖组比较，脂多糖联合1，25(OH)2D3组HK-2细胞吸光度值明显降低，细胞增殖明显抑制(P<0.01)。见表1。

表1 各组HK-2细胞增殖情况比较

1)与正常对照组比较；2)与脂多糖组比较:均P<0.01；下表同

2.2各组HK-2细胞周期分布比较 与正常对照组比较，脂多糖组HK-2细胞G0/G1期比例明显降低，S期及G2/M期比例明显增加，增殖指数明显升高(均P<0.01)；1，25(OH)2D3组HK-2细胞G0/G1期比例明显升高，S期及G2/M期比例明显降低，增殖指数明显降低(均P<0.01)。与脂多糖组比较，脂多糖联合1，25(OH)2D3组HK-2细胞G0/G1期比例明显升高，S期及G2/M期比例明显降低，增殖指数明显降低(均P<0.01)。见图1、表2。

图1 各组HK-2细胞细胞周期分布比较

表2 各组HK-2细胞细胞周期分布及细胞凋亡率比较(%)

2.3各组人肾小管上皮细胞细胞凋亡比较 细胞凋亡率低，其凋亡率为(2.72±0.46)%。与正常对照组比较，脂多糖组HK-2细胞凋亡率明显降低(P<0.01)；1，25(OH)2D3组HK-2细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。与脂多糖组比较，脂多糖联合1，25(OH)2D3组HK-2细胞凋亡亦明显增加(P<0.01)。见表2与图2。

图2 各组HK-2细胞凋亡率比较

3 讨 论

目前，对于CKD的发病机制仍无统一认识。肾小管上皮细胞转分化是各种肾脏疾病进展到终末期肾病的主要病理基础，也是肾小管间质纤维化发生过程中的关键环节。因此，寻找能够逆转肾小管上皮细胞转分化的因子或药物，对于临床上防治CKD，改善CKD预后具有重要意义〔9〕。1，25(OH)2D3经典的生理作用为调节钙磷代谢。1，25(OH)2D3可抑制肾脏细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡，进而发挥其肾脏保护作用〔10～13〕。本文提示脂多糖能显著促进HK-2细胞的增殖。1，25(OH)2D3能显著抑制HK-2细胞的增殖，1，25(OH)2D3可能通过某种机制逆转脂多糖对HK-2细胞的促增殖作用。细胞增殖的过程，其本质是DNA复制的过程。本文结果说明脂多糖能够显著促进HK-2细胞等增殖。1，25(OH)2D3能够显著抑制HK-2细胞的增殖。1，25(OH)2D3可能通过某种机制逆转脂多糖对HK-2细胞的促增殖作用。

正常情况下，细胞的增殖与细胞凋亡处于动态平衡〔14〕，当细胞受外界细胞因子或炎症因子的作用，细胞的这种平衡将被打破，进而导致疾病的发生。在肾脏疾病炎症的修复过程中可以通过细胞凋亡来消除过度增殖的细胞〔15〕。本文结果说明脂多糖可显著抑制HK-2细胞凋亡。1，25(OH)2D3能够显著促进HK-2细胞的凋亡。1，25(OH)2D3可能通过某种机制逆转脂多糖对HK-2细胞凋亡的抑制作用。

4 参考文献

1Zhang L，Wang F，Wang L，etal.Prevalence of chronic kidney disease in china：a cross-sectional survey〔J〕.Lancet，2012；379(9818)：815-22.

2Lin B，Shao L，Luo Q，etal.Prevalence of chronic kidney disease and its association with metabolic diseases：a cross-sectional survey in Zhejiang province，Eastern China〔J〕.BMC Nephrol，2014；15(1)：36.

3Wada J，Makino H.Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕.Clin Sci，2013；124(3)：139-52.

4陈建平，张春江，赵 丹，等.1，25-二羟基维生素D3对人系膜细胞增殖与凋亡的影响〔J〕.实用医学杂志，2014；30(3)：342-5.

5Zhang Z，Yuan W，Sun L，etal.1，25-Dihydroxy vitaminD3 targeting of NF-kappaB suppresses high glucose-induced MCP-1 expression in mesangial cells〔J〕.Kidney Int，2007；2(2)：193-201.

6Min B.Effects of Vitamin D on blood pressure and endothelial function〔J〕.Korean J Physiol Pharmacol，2013；17：385-92.

7Abdi-Ali A，Nicholl DD，Hemmelgarn BR，etal.25-Hydroxyvitamin D status，arterial stiffness and the renin-angiotensin system in healthly humans〔J〕.Clin Exp Hypertens，2014；36：386-91.

8Tiong WN，Sim EU，Fong AY，etal.Early detection of C-reaction protein and Willebrand factor levels in Malaysian patients with actue coronary syndrome〔J〕.J Cardiovasc Dis Res，2013；4(1)：3-6.

9Qiu G，Ji Z.AngⅡ-induced glomerular mesangial cell proliferationinhibited by losartan via changes in intracellular calciumion concentration〔J〕.Clin Exp Med，2014；14(2)：169-76.

10Jiang YJ，Teichert AE，Fong F，etal.1alpha，25(OH)2-dihydroxy vitaminD3/VDR protects the skin from UVB-induced tumor formation by interacting with the beta-catenin pathway〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，2013；136：229-32.

11Huang Y，Luo F，Li H，etal.Conditioned medium from alternatively activated macrophages induce mesangial cell apoptosisvia the effect of fas〔J〕.Exp Cell Res，2013；319(19)：3051-7.

12张 昊，尹 璇，陈建平，等.活性维生素D3对人系膜细胞凋亡及Caspase-3表达的影响〔J〕.中国全科医学，2015；18(5)：540-3.

13尹 璇，张 昊，陈建平，等.1，25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞增殖及PCNA表达的影响〔J〕.天津医药，2014；43(1)：17-9.

14Li R，Lou Y，Zhang W，etal.Vitamin D inhibition of lungadenocarcinoma cell proliferation in vitro〔J〕.Tum Biol，2014；35(11)：10953-8.

15Ma Y，Yu WD，Hidalgo AA，etal.Inecalcitol，an analog of1，25 (OH)2 D3 displays enhanced antitumor activity through the induction of apoptosis in a squamous cell carcinoma model system〔J〕.Cell Cycle，2013；12 (5)：743.